免疫检查点在结核病治疗中的作用

吴娟 石文 谈绮 解卫平 王虹

南京医科大学第一附属医院呼吸与危重症医学科210029

结核病是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,Mtb)引起的慢性呼吸道传染病,是全球第二大常见的传染病,也是最常见的死亡原因之一。2017年全球约有1 000万新发病例,约2/3来自于包括中国在内的发展中国家[1]。结核病发病机制与机体免疫密切相关,大多数感染Mtb的个体都会产生保护性免疫应答,终身处于无症状的结核潜伏感染(latent Mtb infection,LTBI)状态,只有约5%～10%的HIV 阴性的LTBI可能进展为活动性结核病(active tuberculosis,ATB)[2]。免疫功能减弱可能导致LTBI复发。

免疫检查点是免疫系统中提供共抑制信号的调节因子,有利于机体维持自身耐受及避免自身免疫发生,保持机体共刺激和共抑制信号之间的平衡对维持机体免疫稳态至关重要。感染后免疫检查点提供的抑制信号可通过控制免疫反应的时间和强度减轻组织损伤,但其持续的高表达状态可能导致T 细胞耗竭,不利于结核感染的控制。因此,调节免疫检查点功能,有望成为结核病控制的新手段。目前越来越多研究显示,免疫检查点可能参与了结核病的发病、疗效及转归。目前认为免疫检查点包括程序性死亡分子受体1(progmmmed death-1,PD-1)、细胞毒T 淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)、T 细胞免疫球蛋白黏蛋白3(T cells immunoglobulin mucin 3,TIM-3)、淋巴细胞活化基因3(lymphocyte activation gene-3,LAG-3)等[3-4]。已有大量研究显示结核感染使体内多种免疫细胞表面的免疫检查点分子表达上调,这些分子参与了机体固有免疫与适应性免疫过程,并与T 细胞耗竭密切相关,有望成为结核病的新型治疗靶点。

1 结核病的免疫学机制

结核感染是病原体与宿主免疫系统相互斗争的过程。Mtb为胞内寄生菌,宿主免疫反应以CD4+和CD8+T 淋巴细胞介导的细胞免疫应答为主。Mtb入侵后,包括树突状细胞及巨噬细胞在内的抗原呈递细胞(antigen presenting cell,APC)通过模式识别受体识别Mtb,诱导自身成熟和活化,促进效应细胞因子的释放、共刺激分子的表达和杀菌分子的产生。随后载有 Mtb抗原的APC 向次级淋巴器官迁移,将抗原呈递给T 细胞。T 细胞受体(T cell receptor,TCR)识别APC上的抗原肽-主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)Ⅰ/Ⅱ复合物后启动T 细胞介导的免疫应答,但是由MHC提供的第一信号不足以活化初始T 细胞,还需要由多种协同共刺激分子受体与其配体结合后提供的协同共刺激信号的参与,才能完全激活T 细胞,促使其增殖并迁移至感染部位,最后直接或间接通过其他效应细胞或因子发挥抗感染作用[3]。

T 细胞耗竭是指持续的抗原刺激后T 细胞进入的一种低功能的状态,主要表现为T 细胞增殖能力降低、相关细胞因子释放减少和T 细胞表面抑制性受体增加[5-6]。大量体内和体外研究发现长期Mtb刺激使T 细胞对Mtb特异性抗原的免疫应答能力下降,伴有T 表面PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3等抑制性受体的表达增加,阻断这些抑制性受体的表达,可以增强机体对Mtb的免疫应答反应。因此,T 细胞耗竭是结核病慢性持续感染的主要机制之一,T 细胞表面增高的抑制性受体,可作为T 细胞耗竭的标志物,有望成为未来结核治疗的新靶点[5]。

2 免疫检查点和结核病

2.1 PD-1/程序性死亡分子配体1(programmed cell death 1 ligand 1,PD-L1)通路 PD-1是CD28/B7超家族成员,主要表达于活化的T 细胞、B 细胞、自然杀伤(natural killer,NK)细胞和单核细胞表面,多种刺激物均可使其表达上调。PD-1与PD-L1结合后,通过抑制T 细胞增殖与活化、促进抗原特异性T 细胞凋亡、减少调节性T 细胞(regulatory T cell,Treg)凋亡等机制,抑制结核感染宿主的免疫反应[7]。

与健康人、LTBI人群相比,活动性结核患者外周血CD4+T 细胞、NK 细胞、中性粒细胞、单核细胞等细胞表面 PD-1、PD-L1表达增高,干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、IL-2等细胞因子分泌减少。有效的抗结核治疗可减少PD-1、PD-L1 的表达,阻断PD-1 可减少 T 细胞凋亡[8-9]。此外,PD-1 可能也参与了结核患者的耐药形成,Li等[10]发现耐多药结核(multidrug-resistant tuberculosis,MDR-TB)患者外周血Treg比例,较药物敏感组及健康组显著增高,而且与Treg表面PD-1的表达量相关。研究发现结核感染过程中,PD-1/PD-L1可同时抑制人体的固有免疫和适应性免疫,阻断PD-1/PD-L1 信号通路不仅可以增强巨噬细胞吞噬活性和其对胞内病原体的杀伤活性[11],还可以增强CD4+T 淋巴细胞的增殖、活化及黏附能力,促进IFN-γ、IL-2等效应细胞因子的分泌,减少Th1细胞的凋亡[8]。但Day等[9]认为PD-1的适当表达可增强Mtb特异性CD4+T 细胞免疫,他们通过体外Mtb刺激结核患者的CD4+T 细胞,发现PD-1高表达的CD4+T 细胞具有更强的增殖能力,更高的分泌Th1型细胞因子的能力。目前还没有应用PD-1/PD-L1抗体治疗结核病的临床研究及报道,但有临床病例报道非小细胞肺癌合并LTBI的患者,使用抗PD-1单克隆抗体治疗,LTBI发展为ATB,肺活检病理显示弥漫性淋巴细胞浸润,提示过度的免疫反应可能参与了结核病的发展[12]。

动物实验发现,PD-1基因敲除可使小鼠对结核病易感性增加,Mtb特异性T 淋巴细胞增殖降低,Treg细胞比例增高,自噬相关蛋白表达降低,表现为肺部过度的炎症及坏死、Mtb快速生长繁殖,过度的免疫反应引发的组织损伤是导致结核感染小鼠死亡的原因之一[13-14]。该研究结果提示PD-1通过抑制机体过度免疫反应,对机体发挥免疫保护作用。

因此,免疫细胞基础水平的PD-1表达有利于维持免疫系统稳定,但PD-1的持续、过度表达,可导致免疫功能下降甚至缺陷,PD-1在结核感染中的作用和相关机制值得进一步研究,通过调控PD-1的表达,协助抗结核药物更好的控制结核病。

2.2 CTLA-4通路 CTLA-4也是CD28/B7超家族成员,主要表达在活化的T 细胞、Treg 细胞上。APC 可通过MHC-TCR 相互作用向T 细胞呈递抗原,并通过CD80/CD86与T 细胞表面CD28的结合来刺激T 细胞活化,而CTLA-4在结构上与CD28 相似,且在结合CD80 和CD86方面拥有比CD28 更高的亲和力。因此CTLA-4 可竞争性结合APC表面的CD80 和CD86,阻断CD28 的共刺激信号,抑制T 细胞活化[15]。

体外实验研究结果发现,与健康人相比,结核患者外周血中CD4+T 细胞表面的PD-1、CTLA-4表达增加,并与Mtb特异性IFN-γ水平显著相关[16],有效的抗结核治疗可以促进Mtb特异性CD4+T 细胞增殖、分化和分泌效应细胞因子,降低PD-1、CTLA-4的表达量,且CTLA-4降低更明显[8]。CTLA-4可能还与结核病患者的Th17细胞、滤泡辅助性T(T follicular helper,Tfh)淋巴细胞、Treg细胞等免疫细胞功能相关。Th17 细胞是除Th1 细胞外,具有协调抗结核作用的重要的淋巴细胞类型,其分泌的细胞因子IL-17和IL-23 对结核感染的早期非常重要。Babu等[17]报道结核感染患者体内Th17细胞因子水平降低,并与CTLA-4的水平呈负相关,体外阻断CTLA-4 可增加Th17细胞因子水平。Tfh细胞是促进和维持体液免疫所必需的一个CD4+T 细胞亚群。Kumar等[18]发现ATB 患者体内Tfh细胞的比例明显低于LTBI组,体外阻断CTLA-4则可上调 Mtb 抗原诱导 Tfh 细胞比例。与PD-1 相似,CTLA-4也可能与结核患者的耐药性相关。Li等[10]报道MDR-TB患者外周血中显著增高的Treg细胞比例与其表面PD-1的表达量相关。最近Davids等[19]也发现泛耐药结核病患者外周血Treg细胞比例较药物敏感组和LTBI组增高,敲除CTLA-4基因可减弱Treg细胞对抗结核免疫反应的抑制作用。此外,CTLA-4 基因表型可能和结核病的发病风险及疾病严重程度相关[20]。CTLA-4是定量调节机体免疫稳态的关键因子,基因敲除和CTLA-4阻断抗体治疗诱导的CTLA-4缺陷都可能导致免疫失调和自身免疫性疾病的发生[21],CTLA-4阻断剂在肿瘤治疗中已获得广泛的关注和认可,但在结核病防治中的应用研究还需进一步加强。

在结核小鼠模型上,Mtb 抗原可诱导Th1 细胞和Th17细胞表面CTLA-4 表达上调,与 Th1 细胞相比,Th17细胞的CTLA-4表达量显著增加,体外阻断实验表明Th17细胞对CTLA-4共抑制更敏感,而对CTLA-4免疫球蛋白的抑制作用不敏感[22]。

因此,CTLA-4在结核感染中主要发挥免疫抑制作用,其有望成为控制结核病的有效靶点,但其在结核病发病机制中的具体机制仍需进一步研究。

2.3 TIM-3/半乳糖凝集素-9(galectin-9,gal-9)通路

TIM-3属于免疫球蛋白超家族,主要表达于T 细胞、巨噬细胞和树突状细胞表面。gal-9是TIM-3的配体之一,gal-9通过与Th1细胞表面TIM-3-Ig V 结构域上的寡糖链相互作用,负向调控Th1型免疫应答[3]。

体外实验发现,与LTBI组、健康组相比,ATB 患者CD4+T 细胞、CD8+T 细胞、NK 细胞、Tfh细胞表面的TIM-3表达增高,体外Mtb抗原刺激也可增加TIM-3表达水平,TIM-3表达水平与免疫细胞功能缺陷、肺结核病情严重程度有关,抗结核治疗后细胞TIM-3 表达水平降低,体外阻断TIM-3可促进免疫细胞活化,增加效应细胞因子的分泌[23-24]。Sada-Ovalle等[25]对 HIV 感染患者和健康人研究发现,体外阻断T 细胞表面的TIM-3、PD-1,可增强巨噬细胞和T 细胞共培养体系抑制Mtb增殖的能力。与单独阻断TIM-3相比,同时阻断TIM-3 和PD-1,抗菌效果无明显改变,而单独阻断PD-1,抗结核菌效果减弱,提示在抑制T 细胞效应中,TIM-3 可能比PD-1 发挥更重要的作用。以上结果提示,与PD-1相似,TIM-3的表达可抑制免疫系统抗Mtb感染的能力,且与PD-1 相比,TIM-3 可能发挥更重要的作用。

在小鼠模型中,结核菌慢性持续感染可增加Th1细胞在内的CD4+T 细胞表面TIM-3的表达,T 细胞功能的耗竭,TIM-3阻断有利于恢复T 细胞功能,抑制结核菌的生长繁殖[26]。另外,Kim 等[27]发现 Mtb可通过促进树突状细胞表达PD-1、PD-L1、TIM-3等免疫检查点分子的表达,抑制其免疫活性,抑制Th1型细胞免疫功能,有利于结核菌的生长繁殖。与PD-1、CTLA-4相似,TIM-3也有望成为治疗结核病的新靶点。

2.4 LAG-3通路 LAG-3属于免疫球蛋白超家族,主要表达在活化的T 淋巴细胞、NK 细胞和树突状细胞表面,与CD4分子结构相似,可竞争性抑制CD4-MHC-Ⅱ抗原呈递作用,抑制Th1 型细胞免疫[4]。Phillips等[28]报道,感染Mtb的猕猴肺组织CD4+T 细胞的LAG-3的表达增加,其表达量与Mtb负荷相关；阻断LAG-3 可增强机体免疫系统对Mtb的杀伤作用,同时伴有线粒体电子转运的减少和IFN-γ表达的增加,提示在结核感染过程中,LAG-3可能通过干扰线粒体凋亡途径,抑制Th1型免疫应答。因此LAG-3在结核发病机制中可能发挥了免疫抑制的作用,但其在结核病控制中的研究相对较少,需要进一步研究其作用机制及其临床应用。

3 总结与展望

上述免疫检查点抑制剂已在恶性肿瘤,特别是黑色素瘤、肺癌、前列腺癌等的治疗中显示了良好的应用价值[13,29],以上研究结果已经显示了免疫检查点抑制剂在结核病发生发展中的作用及其临床应用前景。针对免疫检查点信号通路的治疗策略是一种较有前景的针对结核感染宿主的免疫治疗手段。PD-1、CTLA4、TIM3、LAG3等免疫检查点可通过多种机制干预宿主免疫细胞的功能,在结核感染的免疫机制中发挥重要作用,有望成为结核病治疗的新靶标。未来免疫检查点在结核病中的作用及其机制仍需进一步研究,未来更好的用于结核病的有效控制。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突