硫化氢对贲门失弛缓症动物模型食管重塑的治疗作用

陈秋宇 赵 威 张 馨 张莉莉 王 彬 晋 弘 王邦茂

天津医科大学总医院消化内科(300052)

背景：贲门失弛缓症是一种病因尚不明确的食管动力障碍性疾病，表现为食管壁内神经丛不可逆性损伤导致下食管括约肌(LES)松弛功能障碍。研究发现贲门失弛缓症患者的食管下端平滑肌呈现重塑现象。目的：探讨硫化氢治疗对贲门失弛缓症动物模型食管重塑标志物表达的影响。方法：予BALB/c小鼠LES注射苄基二甲基十四烷基氯化铵(BAC)建立贲门失弛缓症动物模型，并予腹腔注射外源性硫化氢供体硫氢化钠。比较接受与未接受硫化氢治疗的模型小鼠以及对照组小鼠的食管测压结果，以免疫组化染色检测食管重塑标志物肌动蛋白、弹性蛋白表达。结果：成功建立贲门失弛缓症小鼠模型。与对照组相比，模型组和治疗组小鼠LES压力增高，肌动蛋白、弹性蛋白表达增强(P<0.05)，治疗组上述指标的变化均轻于模型组(P<0.05)。结论：贲门失弛缓症动物模型食管下端存在重塑现象，硫化氢治疗可抑制食管重塑，为硫化氢用于治疗贲门失弛缓症提供了理论依据。

贲门失弛缓症是一种罕见的食管动力障碍性疾病[1]。食管动力障碍性疾病芝加哥分类3.0根据高分辨率食管测压结果将其分为三个亚型，不同分型的治疗手段和预后各异[2]。近年来，对贲门失弛缓症的治疗主要是以经口内镜下肌切开术(peroral endoscopic myotomy, POEM)为代表的有创性治疗，长期预后有待进一步观察[3]。贲门失弛缓症的病因尚不明确，病毒感染、免疫等因素可能与其发病有关[4-5]，通过致食管壁内神经丛损伤，使下食管括约肌(lower esophageal sphincter, LES)松弛功能发生障碍[6-7]。与慢性心力衰竭心室重塑的病理生理学机制相似，贲门失弛缓症患者的食管下端平滑肌呈现重塑现象[8]，包括食管下端代偿性扩张、食管壁肌层增厚并有明显的纤维化和胶原沉积，平滑肌细胞中可见肌动蛋白等标志物表达增高[6-9]。本实验通过分析硫化氢治疗贲门失弛缓症动物模型对食管重塑现象相关标志物肌动蛋白、弹性蛋白表达的影响，探讨硫化氢在贲门失弛缓症治疗中的可能机制。

材料与方法

一、贲门失弛缓症动物模型建立

选取30只6周龄雌性BALB/c小鼠(南京大学模式动物研究所)，初始体质量(19.35±0.20) g，独立适应性饲养于适宜的SPF级实验动物屏障环境中1周。1周后随机分为模型组和对照组，每组15只，记录初始体质量(W0)。以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，采用食管22通道水灌注高分辨率测压系统(Medical Measurement Systems)记录初始LES压力(P0)。经腹部正中切口暴露食管胃连接部，模型组予LES环周肌层注射10 μL苄基二甲基十四烷基氯化铵(BAC, Tokyo Chemical Industry)建立贲门失弛缓症动物模型[10]，对照组予注射等体积0.9% NaCl溶液，逐层关闭腹腔。术后予水饲养1 d后恢复正常饮食饲养。观察小鼠基本情况和体质量变化，记录术后1周、2周、3周体质量W1、W2、W3，于第3周末再次测量LES压力(P1)，并行食管造影检查。完成上述检查后处死所有小鼠，取LES处标本行肌动蛋白、弹性蛋白免疫组化染色。

二、硫化氢治疗实验

另选取45只6周龄雌性BALB/c小鼠，独立适应性饲养1周，条件如前。1周后随机分为模型组、治疗组和对照组，每组15只，记录初始体质量(W0)和初始LES压力(P0)。三组动物分别予相应实验操作。①模型组：开腹BAC食管肌层注射+PBS腹腔注射21 d。②治疗组：开腹BAC食管肌层注射+14 μmol/kg硫氢化钠溶液(上海新华化工厂)腹腔注射21 d。③对照组：开腹0.9% NaCl溶液食管肌层注射+PBS腹腔注射21 d。BAC造模操作步骤如前所述。记录术后1周、2周、3周体质量W1、W2、W3，于第3周末再次测量LES压力(P1)。完成上述检查后处死小鼠，取LES处标本行肌动蛋白、弹性蛋白免疫组化染色。

三、重塑标志物免疫组化染色

小鼠LES标本常规石蜡包埋、切片，经脱蜡、水化、抗原修复、清洗等步骤后，行血清封闭并孵育；先后滴加经稀释的肌动蛋白抗体或弹性蛋白抗体(Abcam plc.)和相应二抗(Roche Diagnostics)并孵育，清洗、封片、干燥后由病理医师阅片。

结果判断：切片置于光学显微镜下，每张切片随机选取5个视野(×400)进行观察，目的染色颗粒为棕色颗粒。免疫组化评分按阳性染色面积在视野中所占比例分为四个等级[11]：大量明显棕色颗粒平均散在分布于视野中(>50%)为Ⅰ级(3分)；棕色颗粒片状分布于视野中(26%～50%)为Ⅱ级(2分)；棕色颗粒单一分布于视野中(11%～25%)为Ⅲ级(1分)；很少或完全不可见棕色颗粒(0～10%)为Ⅳ级(0分)。

四、统计学分析

结 果

一、贲门失弛缓症模型评估

造模实验过程中，模型组和对照组小鼠均存活。模型组小鼠于食管肌层注射BAC后第2周开始出现进食减少、皮毛杂乱、活动减少等表现，对照组小鼠较前无明显变化。BAC处理前，两组小鼠体质量无明显差异(P>0.05)；处理后1周，两组体质量均有所增长，组间差异无统计学意义(P>0.05)；处理后2周，模型组体质量增长减缓，第3周较第2周下降，对照组则保持增长趋势，两组间差异有统计学意义(P<0.05；表1)。

表1 造模实验中模型组和对照组体质量变化

高分辨率食管测压结果显示，BAC处理前两组小鼠LES压力差异无统计学意义(t=-0.53,P=0.96)；处理后3周末，模型组LES压力明显增高，两组间差异有统计学意义(t=4.78,P<0.05；图1)。

1 mm Hg=0.133 kPa

综合造模实验前后模型组与对照组体质量和LES压力的变化趋势，且模型组小鼠食管造影可见造影剂通过困难(图2)，符合贲门失弛缓症的相关临床表现和影像学特征，认为已成功建立贲门失弛缓症小鼠模型。

A：模型组，造影剂通过困难；B：对照组，造影剂通过顺利

免疫组化染色显示，肌动蛋白、弹性蛋白染色颗粒在模型组LES中的分布明显多于对照组，免疫组化评分明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05；图3、表2)，表明贲门失弛缓症小鼠模型食管下端重塑标志物表达上调，模型小鼠可能存在食管重塑现象。

图3 造模实验中模型组和对照组LES两种重塑标志物免疫组化染色(×400)

表2 造模实验中模型组和对照组LES两种重塑标志物表达比较

二、硫化氢治疗降低贲门失弛缓症动物模型重塑标志物表达

模型组、治疗组和对照组三组小鼠硫化氢治疗实验过程中均存活，体质量和LES压力变化见表3。三组间术前和术后1周体质量差异无统计学意义(P>0.05)；术后2周三组体质量均有不同程度的增长，模型组最缓，对照组最快，治疗组居中，术后3周治疗组体质量增长慢于对照组，模型组体质量下降，三组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。

表3 硫化氢治疗实验中各组小鼠体质量和LES压力变化

三组间术前LES压力差异无统计学意义(P>0.05)；术后第3周末对照组LES压力较前无明显变化，模型组和治疗组均有所增高，模型组增高更为显著，三组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。

免疫组化染色显示，模型组和治疗组LES肌动蛋白、弹性蛋白表达强于对照组，模型组两者表达上调更为显著，三组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05；图4、表4)。

对照组重塑标志物表达最少，模型组表达最多，治疗组居中

讨 论

贲门失弛缓症是一种发病率较低、病变累及平滑肌层的食管动力障碍性疾病，最常见的临床症状为吞咽困难，随着疾病的进展，进食梗阻症状逐渐加重[12]。此外，该病还存在反流、胸痛、体质量减轻等临床表现。尽管目前贲门失弛缓症的病因学研究逐渐增多，但其病因仍未完全阐明。对贲门失弛缓症患者食管组织的研究发现其LES肌间神经丛有不同程度的不可逆性损伤，并有T细胞、B细胞、嗜酸性粒细胞等多种炎性细胞浸润，以及胶原组织替代神经丛的纤维化现象[6-7]，因此有学者提出贲门失弛缓症患者的食管下端存在重塑现象[8]。与慢性心力衰竭患者发生心室重塑相似，食管重塑是对贲门失弛缓症病理状态的代偿性反应。在各种原因导致患者LES肌间神经丛受损后，LES松弛功能障碍，持续高压，即食管下端后负荷增加；LES无法正常松弛，日常进食的食物逐渐堆积于食管下端，所形成的压力随之升高，即食管下端前负荷增加；LES肌细胞进行性代偿性增大、增多，组织中胶原成分增多，食管壁增厚、变硬[8]，提示发生食管重塑。作为组织重塑的标志物，肌动蛋白和弹性蛋白在肺血管重塑动物模型中表达增高[13]。本实验对贲门失弛缓症小鼠模型和对照组小鼠的LES组织进行免疫组化染色，发现前者肌动蛋白和弹性蛋白表达均显著增高，提示模型小鼠LES处可能存在组织重塑现象。

表4 硫化氢治疗实验中各组LES两种重塑标志物表达比较

硫化氢是继一氧化碳、一氧化氮之后第三个被发现的内源性气体信号分子，在体内系由左旋半胱氨酸经催化后合成，研究[14]发现其可与一氧化氮协同调节平滑肌张力，具有松弛平滑肌的作用，是一种新型的抑制性神经递质。笔者所在团队曾对贲门失弛缓症患者食管组织中硫化氢合成酶减少的现象进行研究，发现硫化氢可剂量依赖性地抑制食管收缩活性，内源性硫化氢合成减少参与了贲门失弛缓症的发生[15-16]。近年关于硫化氢在血管生理学中作用的研究逐渐增多[17]，其中包括硫化氢对肺动脉高压患者肺血管重塑的改善作用[18]。本研究予贲门失弛缓症小鼠模型腹腔注射外源性硫化氢供体硫氢化钠，观察其对食管重塑的影响。实验结果显示，与未予硫化氢治疗的模型小鼠相比，经硫化氢治疗21 d的模型小鼠LES重塑标志物肌动蛋白、弹性蛋白表达明显减少，提示硫化氢治疗可改善贲门失弛缓症食管重塑现象，同时模型小鼠的LES压力升高和体质量减轻亦明显好转，为硫化氢治疗贲门失弛缓症提供了实验依据。

综上所述，贲门失弛缓症动物模型食管下端存在重塑现象，硫化氢治疗可抑制食管重塑。本实验为初步研究，未进一步分析其他食管重塑相关指标，亦未明确食管组织中的硫化氢水平，有待后续实验加以完善。此外，尚需深入探讨硫化氢作用于食管重塑的具体机制，为硫化氢用于治疗贲门失弛缓症提供更多理论依据。