茶树组织培养研究进展

刘 静

（安康学院 现代农业与生物科技学院，陕西 安康 725000）

茶树[Camellia sinensis（L.）O.Kuntze]属于山茶科山茶属植物，在我国栽培历史悠久，是我国重要的经济作物[1]。茶叶中含有大量对人体有益的化学成分及营养物质，具有很高的医疗保健价值[2]。长期以来，茶树主要靠种子繁殖，但种子繁殖容易发生性状分离，导致优良性状丢失，从而引起品种退化。近年来生产上推广无性系茶园，利用茶树的枝条进行扦插繁殖[3]，但该方法存在着育苗周期长、繁殖系数低、对自然环境要求较高的缺陷，限制了茶树新品种的繁育和推广[4]。

植物组织培养技术是指将植物的离体器官接种于含有特定营养成分的培养基上，使植物离体器官向着人们预先设计的方向生长和发育，以取得在常规繁殖方式下难以取得成效的一种生物技术[5]。茶树组织培养主要利用叶片、茎段、腋芽以及根等外植体进行诱导来获得完整的植株。这种无性繁殖的方式有利于保持茶树优良性状及集约化生产[6]。

1 茶树组培研究进展

1.1 外植体选取

目前，茶树已实现了利用茎尖、叶片、子叶、腋芽、花药等为外植体来诱导芽、愈伤组织、胚状体等，进而培育出新的器官或植株。

1.1.1 茎段、腋芽

Nakamura Y[7]对茶树腋芽进行组织培养，腋芽萌发生长较好，获得再生植株，但成梢率低，生长缓慢。黄亚辉[8]利用茶树茎尖获得了愈伤组织。Akula A等[9]通过茶树茎段培养，诱导出体胚，并建立了茶树的再生体系，诱导率可达60%。张建华等[10]以新梢腋芽、茎段为材料，诱导出愈伤组织并分化出芽。袁地顺等[11]消毒茶树幼嫩芽叶后，将其切成块接种于固体培养基3周后，在切口处产生了少量的愈伤组织。Kato M[12]用茎段为材料，诱导出了愈伤组织和完整植株。

1.1.2 叶片、叶柄

Kato M[12]在不同浓度的2,4-D条件下，对茶树试管苗未成熟的叶片进行培养。从叶片直接诱导出体细胞胚胎或在叶子基部诱导产生胚性愈伤组织，胚胎诱导与叶片外植体的成熟度有关，幼嫩的叶片更好。叶片外植体的胚胎发生的反应也与培养时期液体培养基中的2,4-D的浓度有关，胚胎发生的愈伤组织或重复的体细胞胚胎保持其再生能力超过3年。组织学观察表明，叶中脉不同部位形成体细胞胚。体细胞胚在含有BA和IBA的琼脂培养基上发芽发育成植株。刘德华等[13-14]以叶为外植体，诱导出了愈伤组织并且分化出植株，初步建立了植株再生体系。王毅军等[15]利用茶树叶片诱导出愈伤组织和胚状体，并进一步形成了小植株。严学成等[16]通过器官发生途径培养茶树叶片，获得了正常的小植株，且克服了组织培养中的褐化现象。暨淑仪等[17]利用叶片诱导产生出愈伤组织。杜鸿标等[18]研究发现，诱导茶树叶片产生愈伤组织宜选用第二叶作为外植体，污染率及褐变率相对较低，可获得最高诱导效率31.4%。

1.1.3 子叶

莫典义[19]以子叶为外植体，诱导出胚状体并再生出植株。颜幕勤等[20]用茶树子叶诱导形成胚状体。几周后胚状体即可长成小植株，待胚根长到一定长度时进行移栽。陈平等[21]利用子叶诱导出愈伤组织并分化出丛生苗，移栽成活。Arulpragasam P V等[22]从子叶培养中获得胚状体，并再生出植株。刘德华等[23]培养茶籽子叶柄和下胚轴，子叶柄不经愈伤组织可直接分化出芽，是保持种性的一种较好材料。下胚轴分化芽能力较强，繁殖系数大，对杂交育种有重要意义。Ponsamuel J等[24]培养子叶胚获得完整植株。

1.1.4 花药

日本学者胜尾清等[25]最早开始茶树花药的研究，并获得愈伤组织和根。陈振光等[26-27]用“福云7号”茶树花药，诱导产生愈伤组织，获得完整的植株。郭玉琼等[28]研究花药时，发现蔗糖浓度和基本培养基条件相同时，2,4-D浓度增加有助于提高花药愈伤组织的诱导率。其他条件不变时，随着蔗糖浓度的升高花药愈伤组织诱导率下降，适于茶树花药愈伤组织诱导的蔗糖浓度为5%～7%。杨娟[29]发现，植物花期、植物激素浓度、品种差异等都会影响茶树花药愈伤组织诱导。诱导愈伤组织的茶树花药选用以即将开放花苞为宜，愈伤组织出愈率相对较高，在培养基MS+0.5 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L KT中，出愈率高达34.4%，在相同条件下，花药愈伤组织诱导能力会随茶树品种不同而有差异。在茶树不同品种花药愈伤组织诱导研究报道中，仅“福云7号”的花药诱导形成植株，而分化得到的单倍体及纯合二倍体诱导研究未有继续报道。

1.2 基本培养基选择

培养基是根据植物的生长要求，人工配制的含有多种营养成分的营养液，主要包含大量元素、微量元素、有机成分、植物生长调节剂、琼脂和蔗糖等。植物组织培养能否成功，不仅与培养材料有关，还与培养基的类型有很大的关系。茶树组织培养的培养基主要有：MS、1/2MS、改良MS、ER、MT，其中以MS培养基应用较为广泛[30]。日本学者Nakamura Y[31]研究发现，Nitsch、Gamborg和MS培养基对顶芽的诱导生长比较好。Kuboi T等[32]认为B5液体培养基比固体培养基更有利于茶树愈伤组织的生长。Mondal T K等[33]比较了不同浓度的BAP和TDZ对芽或新梢诱导和增殖的效果，发现在以MS为基本培养基的组合上外植体的生长比以WPM为基本培养基的组合上生长的要好。张建华[10]研究发现，茶树组织培养，尤其是增殖培养中，ER培养基比MS培养基更适合。张娅婷等[34]培养薮北茶树芽苗时发现，在附加等量植物生长调节剂的MS、N6和White培养基上，MS培养基在芽苗的数量和芽苗的高度方面均优于其他两种基本培养基。杨国伟等[35]报道，就茶树愈伤组织的生长而言，MS培养基比Heller、White培养基更优，愈伤组织在MS培养基上诱导率可达到90%，并认为MS培养基中的大量元素对茶树组织培养有很大影响。成浩等[36]研究发现，1/2MS培养基有利于山茶科植物茎段的诱导和生长，还能够有效减少茎段的褐化率。张娅婷等[34]发现，1/2MS培养基比MS培养基效果好，并认为MS培养基中含有的较高浓度无机离子对芽苗的分化起到了一定的抑制作用。但在组织培养应用中，全量的大量元素一般被用于诱导和增殖培养，而半量的大量元素在生根培养时采用。

1.3 生长调节剂选择

在外植体愈伤组织的诱导和器官分化过程中，植物生长调节剂起着明显的调节作用，外源激素种类与配比对外植体能否成功启动起着至关重要的作用。王立等[37]以未成熟胚为外植体，在改良的ER+2.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA培养基上诱导愈伤组织，诱导率为100%，诱导出了合子胚、不定胚及不定芽并形成完整植株。孙仲序等[38]在培养基MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L ZT中得到最佳芽分化率，在培养基为1/2MS+0.2 mg/L IBA+20 g/L蔗糖中得到最佳生根率。周健等[39]研究了激素对茶树芽增殖和生长的影响，认为组培苗增殖的最佳培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+3.0 mg/L GA3。杨国伟等[35]报道，MS+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2,4-D组合对茶树愈伤组织的诱导效果较好。陈玉玲等[40]研究发现，用茶树叶片和茎段为外植体，茎段诱导愈伤组织的效果好于叶片，诱导茎段愈伤组织的最佳培养基为MS+0.4 mg/L 6-BA+2.0 mg/L 2,4-D。姚永宏等[41]认为诱导茶树幼茎愈伤组织最适培养基为MS+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L KT。袁毅君等[42]研究发现，利用茎段诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+2.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L NAA，最佳的叶片愈伤组织诱导培养基为MS+0.5 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT。在茶树组织培养中，两类常用的植物激素是生长素（2,4-D、NAA、IBA）和细胞分裂素（6-BA、KT、ZT），它们的种类、浓度与比例均对外植体诱导和增殖起着很大的作用。一般来说，在进行增殖培养时，生长素用量通常比较低，生长素含量过高，容易诱导出愈伤组织，但愈伤组织的出现又会导致增殖率降低。此外，细胞分裂素含量高，会对愈伤组织的形成产生抑制作用，但对芽的诱导和生长有一定的促进作用。李家华等[43]在没有添加BA的情况下，发现无丛生芽长出，而在有BA的情况下长出了丛生芽。谭和平等[44]报道，在细胞分裂素（CK）用量相同的情况下，生长素（IAA）比萘乙酸（NAA）对茶树芽的诱导效果更好。

1.4 组织培养条件

茶树组织培养除了与外植体、培养基、植物生长调节剂等方面因素有关外，还与培养时外界环境（温度、光照）有很大关系。钟俊辉等[45]发现，愈伤组织在35℃的环境下培养，将会褐变，甚至枯死。刘德华等[46]研究发现，不定芽的分化率与光照强度呈正相关。雷攀登等[47]报道，升高温度会导致多酚氧化酶活性增加，从而加速外植体的褐化。降低培养温度或暗培养能钝化多酚氧化酶的活性，减少多酚类物质的氧化，明显减轻外植体的褐化。周琳等[48]报道，光质不同会对茶树愈伤组织的生长和内含物积累产生不同的效应，红光处理下茶多酚含量最大，促进外植体的褐化，而蓝光下愈伤组织生长情况较好。

2 展望

外植体的污染是茶树组织培养过程中较难解决的重要问题，主要原因是茶树体内带有较多的内生菌，常规的表面消毒对于内生菌来说效果不是很好，难以控制内生菌的污染，导致茶树组织培养污染率居高不下。另外茶树体内多酚类物质含量较高，组培过程中茶树外植体切割后产生伤口，一些酚类、醌类等有害物质被氧化产生褐色的有害物质，引起外植体发生褐化，继而死亡。以上两种原因使得茶树组织培养体系不稳定，可重复性差，再生频率低，导致茶树离体再生较困难且转化效率极低，很大程度地限制了组培技术在茶树中的应用。因此，今后的研究应加强对茶树组培的基础研究，如防止外植体污染，预防和控制褐化，激素的调控机理，培养条件优化，大田移栽试验等，实现组培苗的工厂化生产。

茶树利用种子繁殖，虽有方法简单、成本低、后代适应性强等优点，但茶树是异花授粉植物，容易发生性状分离，易产生变异，导致优良性状丢失，且种子繁殖生育周期长、座果率低等原因导致很难对其进行遗传改良。利用组织培养技术可为茶树基因转移提供大量的理想受体，将茶树基因工程与组织培养相结合，建立稳定高效的茶树离体再生及遗传转化体系，培育出更多的新优特品种，从而提高茶树育种效率。目前，我国茶树品种逐渐被无性系良种所取代，对于数量稀少的野生茶树和不育或败育率很高的品种，可望通过组织培养技术进行茶树种质资源保存，这对节约时间、空间及维持我国茶树品种的多样性较有意义。