游离肿瘤细胞术后灭活的研究进展

吴军，胡龙霞，刘文斌

1武汉轻工大学医学技术与护理学院，武汉430023

2解放军空军军医大学第一附属医院/西京医院护理部，西安710032

3华中科技大学同济医学院附属协和医院肿瘤中心，武汉4300220

胸腹腔肿瘤切除手术常有肿瘤细胞脱落并发生肿瘤转移复发，其中以胃癌、肝癌、肺癌、食管癌较多见[1-4]。肿瘤细胞脱落与肿瘤患者的浆膜受累程度、TNM分期、肿瘤浸润深度、病理分型、分化程度、淋巴结转移情况及术后转移类型等有关[4-7]。同时，手术也可以增加肿瘤细胞脱落或激活休眠的肿瘤细胞，这类因手术脱落游离且有生物活性的肿瘤细胞即为游离肿瘤细胞（free-tumor cell，FTC），由FTC形成的亚临床转移灶是肿瘤术后播散、转移、复发的主要原因[5]，也是肿瘤患者预后的独立影响因素[8-9]。无瘤技术是指在恶性肿瘤切除手术过程中为了防止或减少肿瘤细胞的脱落、种植和播散而采取的一系列措施，其主要目的是在手术始末灭活、清除FTC，对预防肿瘤转移、复发具有重要意义，而其中关键的环节是胸腹腔冲洗[10]。然而，胸腹腔冲洗时，冲洗液体的选择在诸多研究中各有不同，并且冲洗的条件也有差异。肿瘤复发的模式中有肿瘤细胞的胸膜/腹膜播散、术中脱落种植，而胸腹腔冲洗则可以降低脱落肿瘤细胞的阳性率，从而降低肿瘤转移复发率。1989年，Paget提出的“种子-土壤”学说提到，胸腹腔内肿瘤细胞经多种途径脱落，形成“种子”，手术及创伤性操作等机械性损伤使腹膜间皮组织裸露形成所谓的“土壤”，两者相互作用与其他细胞、化学因子等共同促使FTC转移和肿瘤复发。

1 无瘤技术灭瘤原理

1.1 蒸馏水和生理盐水灭瘤原理

蒸馏水属于不含有形成分和杂质并且渗透压接近于零的低渗液体，人体组织细胞的渗透压为280～310 mOsm/L，因而蒸馏水可以使肿瘤细胞肿胀、裂解，进而灭活肿瘤细胞。由于蒸馏水是低渗液体，其在使肿瘤细胞肿胀的同时也会对正常组织细胞造成损伤，从而影响吻合口愈合；另外，氯离子通道会因竞争或阻断而增强细胞毒作用及加剧低渗性休克。相关研究表明，术后蒸馏水冲洗浸泡后，胃癌患者有血压降低、房性早搏等不良反应发生[11-12]。目前，多数研究支持生理盐水替代蒸馏水作为肿瘤手术的常规冲洗液[13-14]。

1.2 聚维酮碘溶液和乙醇灭瘤原理

表面活化剂聚维酮碘起着载体和协助溶解的作用，在胶粒束中央可以运载不定型的络合物，随着聚维酮碘被稀释而逐渐释放游离碘。游离碘结合有机物后能够迅速地表现出细胞毒性，在短时间内对细胞蛋白产生不可逆性交联作用并杀死原核细胞，对多种细菌、病毒等均有杀灭作用。游离碘被消耗后，络合状态的聚维酮碘又可以释放游离碘，直到可利用的碘被消耗完全。乙醇是蛋白质活性的强烈抑制剂，不仅能够直接固定和破坏细胞内的蛋白质、酶等，而且还可以使肿瘤细胞迅速脱水，从而使肿瘤细胞发生不可逆转的变性而被灭活[15-16]。但是，交联的蛋白会形成保护层，当灭活肿瘤细胞粘黏或重叠时，将会影响乙醇渗透到深层细胞，导致内层细胞的灭活效果欠佳。因而，有研究采用肝素无水乙醇冲洗腹腔，以减少FTC的粘黏[17]。

2 FTC检测方式

2.1 腹膜细胞学

腹膜细胞学（peritoneal lavage cytology，PLC）属于病理细胞学（cytopathology，CP）的一种，是检测FTC存在的金标准[5,18]，其诊断依赖于细胞形态学的改变。PLC不仅可以甄别肿瘤细胞的亚显微结构，而且还可以用来进行肿瘤细胞灭活后计数，对甄别微量肿瘤细胞的特异度较好但灵敏度欠佳[19]。PLC的阳性率较低、漏诊率高，尤其当肿瘤细胞较少并散布在炎性细胞和间皮细胞间时，依靠细胞形态学作出诊断的难度则大大增加；而且，在冲洗过程中肿瘤细胞往往有较明显的退变现象，更增加了诊断的难度[20-21]。

2.2 流式细胞术

流式细胞术（flow cytometry，FCM）可以定性或定量分析细胞，检测FTC的灵敏度高、速度快、可靠性好。结合分子的特异性和分子生物学方法，常用消化道肿瘤标志物癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、细胞角蛋白 20（cytokeratin 20，CK20）及上皮细胞膜抗原（epithelial cell membrane antigen，EMA）检测腹腔肿瘤术后的FTC[22-23]。

2.3 免疫组织化学法

免疫组织化学法（immunocytochemistry，ICC）检测时干扰因素较少，检出率高，操作简单快捷，结合PLC的效果更为明显，尤其在胃癌术后FTC的检测中应用较多。腹腔冲洗液中FTC经过富集后，通过ICC检测EMA、CEA、CK20等大分子，可以证明FTC存在及计算FTC的数量[5-6]。

2.4 其他检测技术

在微量肿瘤细胞的检测中，逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR）技术显示出很好的特异度（48.5%）和灵敏度（55.8%），RT-PCR主要用于筛查信使RNA（messenger RNA，mRNA）[19]，对mRNA采集和检测的要求很高，操作复杂，需要严格对照，费用昂贵[6]；而针对细胞活性测定的磁激活细胞分离术（magneticactivated cell separation，MACS）[24]、台盼蓝染色法和噻唑蓝法也是FTC检测的常用方法[25]。

3 体腔冲洗条件

3.1 冲洗液的温度

热疗能使肿瘤细胞表面结构蛋白变性，改变细胞膜的通透性。相关研究表明，24～26℃的冲洗液会增加患者心脑血管意外、术后腹腔内感染和切口感染的风险，失血量也可能增加，并且还会对机体的凝血功能和免疫功能造成不同程度的抑制[9,26]。30℃冲洗液冲洗前后患者的生命体征有明显变化[8,27]；常温冲洗可以有效减少肿瘤切除术后腹腔壁FTC的粘黏。35～40℃接近患者的体腔温度[28]，36～38℃常为体温维持温度，冲洗过程中患者的生命体征平稳无波动，40～43℃双蒸馏水可以使肿瘤细胞呈破碎样改变，而且对正常组织不会造成明显伤害[28]，超过45℃时正常组织便会受到不可逆损伤。41℃生理盐水冲洗可以明显减少患者术后低体温（手术中体温≤36℃）、寒颤的发生，而且利于血乳酸的清除，降低患者的胰岛素抵抗（insulin resistance，IR），减轻应激反应。相关研究表明，42.5℃/43℃冲洗液冲洗时肿瘤细胞可出现不可逆损伤[29-30]，但目前尚无研究阐明0.5℃的温度差。43～45℃冲洗液冲洗时除了可以增加细胞的通透性外，还可以增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[31]。腹腔热灌注化疗（chemotherapeutic hyperthermic intraperitoneal perfusion，CHIP）中采取 47～50℃冲洗液，当冲洗液温度为50～55℃时，FTC会很快死亡[30,32]，该温度对正常细胞的损伤也很大。但在动物研究中，40～44℃条件下冲洗则可以选择性地杀灭FTC[33]，这在使用蒸馏水和生理盐水作为冲洗液时尤为典型，但是肺癌术中进行切口及胸腔灭瘤冲洗时首选43℃的聚维酮碘稀释液[34-35]。

3.2 冲洗液的浓度

75%～95%乙醇灭菌效果优于生理盐水，乙醇浓度（＜95%）越高，对骨肿瘤细胞的灭活效果就越明显，但是40%乙醇对食管肿瘤细胞的抑制作用较75%乙醇更为明显[36-37]。有效碘稀释度为0.01%～0.50%，随着稀释倍数的增加，游离碘浓度不断升高，抗菌灭瘤活性也不断增强，提示聚维酮碘灭瘤作用的强弱与聚维酮碘的浓度有关，而0.25%～1%聚维酮碘溶液有同等灭菌效应[38]。0.5%的聚维酮碘溶液为临床常规用药，不仅可以达到灭菌效果[39]，还可以促进局部伤口愈合，并且不用配制，可直接使用并且取材快速、方便、成本低。1%～2%聚维酮碘溶液能够灭活多种肿瘤细胞，但是对正常细胞也有一定的细胞毒性。43℃下0.05%聚维酮碘的抑瘤率最高，但也有研究表明1%的聚维酮碘溶液是在安全范围内具有最强杀伤效果的浓度[40]。5%聚维酮碘在小鼠实验中被证明灭活结肠癌FTC的效果明显[41-42]，10%聚维酮碘温热胸腔冲洗和辅助化疗可以降低胸膜间质瘤的复发率[43]。

3.3 冲洗次数和灌洗液体积

体外研究表明，蒸馏水冲洗2～3次灭活FTC的效果比冲洗1次要明显，冲洗次数大于4次，FTC灭活效果与冲洗3次无差异[21,44]。但是肿瘤切除术后无水乙醇冲洗1次的灭瘤效果就已相当于蒸馏水冲洗3次。肿瘤切除手术中，为了减少或灭活FTC，术者常用1.0～4.5 L冲洗液冲洗腹腔，综合相关研究提示，平均会用去（2000±500）ml冲洗液[36,45]。

3.4 冲洗的时间

蒸馏水浸泡5 min即可杀灭器械上的FTC，冲洗14 min后可以引起肿瘤细胞裂解，冲洗32 min后基本可以杀死腹腔脱落的肿瘤细胞。0.01%聚维酮碘作用于结肠肿瘤细胞1 min即可出现明显的生长抑制作用并诱导细胞凋亡，器械浸泡于40℃的0.5%聚维酮碘溶液10 min的灭瘤率能达到90%以上，但在体内的研究表明，该条件下热化疗不能达到上述效果[41]。亦有蒸馏水或生理盐水冲洗15、30、45、60 min的研究，在研究无水乙醇灭活FTC时间区间5～60 s时，10 s FTC灭活率即可达到95%，15 s后趋向稳定且皆大于99%[23,39]。

3.5 其他条件

微波灭瘤原理类似于高温灭菌，常用温度为40～60℃，时间为10～30 min，该类研究以体内研究为主[46]。灭活肿瘤细胞时，在43℃30 min条件下，FTC的灭活率仅为18%，相同时间内温度提升1℃，FTC的灭活率可达到85%。光波分为不可见光和可见光，不可见光有红外线与紫外线，红外线灭瘤原理为加热，紫外线灭瘤原理为直接破坏DNA，两者的灭瘤效应与强度和时间成正比；可见光主要激发核黄素产生光化学反应从而灭活FTC。磁场效应主要是利用Fe3+（Fe3O4）纳米粒子对细胞产生效应，如电泳作用，并对细胞培养液中的负电荷离子的移动速度和排列形式产生影响，使细胞表面蛋白分子带电荷能力和分布改变，最终导致细胞的生物学行为改变[25,47]。

相关研究认为，单纯冲洗难以充分灭活FTC，故额外加入5-氟尿嘧啶、丝裂霉素、环磷酰胺、顺铂、四环素、庆大霉素等化疗药物或抗菌药物进行持续腹腔冲洗/CHIP以增强灭瘤效应[25,48]，这是胃肠癌术后预防腹腔种植和肝转移较重要的手段。甚至有研究将氯己定混入冲洗液以增强FTC的灭活效果，亦有单独探讨Cl-1灭瘤效果的研究。

4 小结与展望

医源性种植即术中接触肿瘤的手套、器械、纱布等相关物品都可以导致肿瘤细胞在手术区域的播散种植、切口种植或局部复发等。在手术操作过程中一定要严格执行无瘤技术，体腔探查动作要轻柔，严禁对肿瘤进行挤压，探查遵循由远及近原则，最后探查原发肿瘤及受累脏器，探查完毕后，更换手套。研究表明，胸腹腔肿瘤切除术后冲洗可以减少FTC并且预防肿瘤胸腹膜种植转移，降低复发率，对提高患者的生活质量有明显作用。但是术后FTC灭活常因患者耐受性和施术者的差异，而选择不同的冲洗液及其冲洗条件。中国学者常常在患者手术后取样，侧重体内研究；国外学者常在动物试验中探索，偏向于体外模拟。

综上所述，FTC检出率与TNM分期、淋巴细胞浸润、转移类型、病理类型等密切相关，但是少有研究说明这是否会增加PLC的假阳性率。无论原来已有的FTC，还是冲洗过程中增加的FTC，通过检测灭活率都能说明冲洗的有效性。但是针对灵敏度低的FTC检查假阴性率是否会增加，已有研究未予以说明。冲洗条件如冲洗次数、温度会影响FTC检出阳性率，甚至已有研究得出某些冲洗条件明确范围，综合文中所述，这些条件也存在分歧，这就给将来可重复性、具体化研究奠定了一定基础。