PTEN-Long在肿瘤治疗中的研究进展△

耿连婷，李春晖，单小松，郑亚北，曾昭穆，郑克彬#

1河北大学医学院，河北 保定071000

2河北大学附属医院神经外科，河北 保定0710000

第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homolog，PTEN）是继p53基因之后又一经典的肿瘤抑制基因，在许多肿瘤中存在缺失或突变，如PTEN磷酸酶结构域中的3个单个氨基酸突变：C124S（脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶活性均丧失）、G129E（仅保留蛋白磷酸酶活性而丧失脂质磷酸酶活性）和Y138L（仅保留脂质磷酸酶活性而蛋白磷酸酶活性丧失）[1-2]。PTEN-L/PTENα、PTEN-M/PTENβ、PTEN-N和PTEN-O是PTEN的4种更长的同工型蛋白产物，它们的起始密码子均位于PTEN经典起始密码子ATG的上游[3]。PTEN-L是2013年Hopkins等[4]发现的一种PTEN翻译变体，与PTEN具有相似的生物活性，发挥肿瘤抑制的作用，是目前研究的重点。对于肿瘤的治疗存在各种各样的困难，基因治疗目前越来越受到重视。

1 PTEN和PTEN-L的结构与功能

1.1 结构

PTEN基因位于人类染色体10q23.31上，由3个结构域组成：N-末端磷脂酰肌醇4，5-双磷酸（phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate，PIP2）结合序列（残基1～7）；双重特异性磷酸酶结构域（由第14～185位氨基酸组成）和C2结构域（由第190～351位氨基酸组成）；含有多个磷酸化位点的50个氨基酸C-末端（由第353～400位氨基酸组成）和C端PDZ结合序列（由第401～403位氨基酸组成）[5]。编码PTEN的mRNA上翻译的起始密码子为ATG，编码一个由403个氨基酸组成的蛋白质。PTEN-L在其N端上游513 bp处选择了非经典翻译起始密码子CTG，编码一个由576个氨基酸组成的蛋白质，相对于PTEN，PTEN-L在其N端多出了173个氨基酸，表达产物的分子量为75 kD，并且该173个氨基酸序列与其他物种预测蛋白序列的对比结果表明PTEN-L在进化过程中高度保守[4]。

1.2 功能

PTEN-L也是一种抑癌基因，在肿瘤细胞中的相对表达量较低。与PTEN相似，PTEN-L以磷酸酶活性依赖性的方式通过阻断磷酸肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又称AKT）信号转导通路，降低PI3K/AKT信号转导通路的磷酸化水平，并且PTEN-L具有更强的磷酸酶活性。特殊的是，PTEN-L比PTEN多编码的173个氨基酸使PTEN-L具有细胞穿透和细胞分泌的作用。该额外序列含有多聚丙氨酸序列，似乎起到了通过经典途径发挥细胞分泌的作用，而且计算机模拟显示PTEN-L额外序列中含有分泌信号序列。在细胞外如细胞培养基、血浆、血清中可检测到PTEN-L的存在。有研究证明，PTEN-L可由细胞内分泌到细胞外。人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）具有转录激活因子蛋白的细胞穿透元件的多碱性残基。PTEN-L多编码的173个氨基酸中具有与该多碱性残基相似的区段，使PTEN-L具有穿透细胞膜的作用，可进入相邻细胞，并使PTEN-L作为外源药物或携带其他外源药物影响细胞信号的传导，阻断PI3K/AKT信号转导通路，从而抑制肿瘤细胞的生长，诱导肿瘤细胞凋亡[4]。

2 PTEN-L信号转导通路

PTEN是在多种类型的肿瘤中存在突变的肿瘤抑制因子，其编码的蛋白具有双重特异性磷酸酶的活性，其主要底物是磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸（phosphatidylinositol 3，4，5-trisphosphate，PIP3）[6]，PTEN可使PIP3去磷酸化，抑制PI3K信号的传导，从而影响肿瘤细胞的生长、增殖和存活[7]。PTEN-L和PTEN具有相似的生物活性，作为PI3K抑制剂，可通过阻断PI3K/AKT信号转导通路及其下游信号转导通路发挥肿瘤抑制作用，如通过抑制PI3K/AKT/雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，MTOR）信号转导通路，影响肿瘤细胞的发生发展、核糖体生物合成、血管生成、自噬及凋亡等过程[8-9]，还可阻断 PI3K/AKT/核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信号转导通路，抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞凋亡。PTEN不但可通过阻断黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）信号转导通路从而抑制肿瘤细胞的侵袭和转移，还可通过阻断促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号转导通路抑制肿瘤的生长和分化，但PTEN-L是否可以通过此途径发挥肿瘤抑制作用有待进一步研究[10]。

3 PTEN-L前导序列在肿瘤治疗中的应用及发展

3.1 PTEN-L前导序列融合蛋白的组装前景

PTEN-L N-末端的173个氨基酸被称为前导序列。PTEN-L前导序列本质上是无序的，并且富含翻译后修饰，可被分泌到细胞外液中，并可重新进入邻近细胞或远处细胞，在体内和体外发挥与PTEN相似的肿瘤抑制作用，增加了PTEN治疗疾病的可行性[11]。肿瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）是一种强大的肿瘤抑制因子。研究显示，将PTEN-L前导序列与转录调节因子TP53结合可组装为融合蛋白PTEN-L-p53，PTEN-L-p53可被分泌至细胞外并穿过受体细胞膜屏障定位于细胞质和细胞核中。PTEN-L前导序列不影响TP53的功能，PTEN-L-p53可显著抑制U251细胞的增殖、侵袭和迁移，发挥肿瘤抑制因子的作用。该融合蛋白由具有低免疫原性的内源性蛋白质和内源性肽段组成，有希望应用于TP53异常的肿瘤治疗[12]。用健康的基因取代突变的基因治疗疾病是很有前景的[13]，与各种人内源蛋白（p53、p16、p21等）融合的PTEN-L前导序列可有效递送治疗性蛋白质，避免了传统载体的缺点，被认为是用于递送治疗性蛋白质的有效载体，为治疗肿瘤提供了一种新颖且直接的方法。

3.2 PTEN-L前导序列工程化版本的构建

PTEN在胶质母细胞瘤中多处于失活状态，胶质母细胞瘤细胞系中PTEN活性的恢复可使肿瘤细胞的增殖和迁移减少，同时对凋亡的易感性增加。多项研究已对PTEN活性的恢复在U87MG细胞中的作用进行了研究，结果显示，PTEN可抑制U87MG细胞的增殖、迁移等[14-16]。PTEN-L可通过外泌体或者裸蛋白的形式分泌并被相邻细胞摄取，因此，PTEN-L可作为恢复PTEN活性的治疗剂，但是，有效透过血-脑脊液屏障递送治疗性蛋白质以治疗中枢神经系统肿瘤具有一定的难度，单核细胞/巨噬细胞、间充质干细胞和神经干细胞具有一定的细胞归巢能力[17-20]，如果将这些细胞工程化以表达治疗性蛋白质，则有可能利用这些细胞的归巢能力以局部持续高浓度的方式递送治疗性蛋白质。有研究表明，神经干细胞通过遗传修饰表达治疗性蛋白质可能能够解决血-脑脊液屏障的问题。另一个问题是，PTEN-L中的聚氨基酸可能是通过脊椎动物进化阶段的核苷酸重复扩增而产生的。核苷酸的积累可以通过自然选择优势来驱动，也可能未通过负选择或遗传漂移而保留下来[21]。这些过程均可能会限制PTEN-L的细胞分泌能力和穿透能力。有研究开发出了一种工程化版本的PTEN-L，它被设计用于增强细胞介导的递送，具有很强的分泌能力和转移至邻近细胞的能力，而这是通过采用来自人轻链免疫球蛋白G的前导序列替换PTEN-L的天然前导序列来实现的[22]。源自人成纤维细胞的神经干细胞可以被修饰以表达PTEN-L，并作为胶质母细胞瘤中蛋白质递送的载体[20,23-25]，且能够将轻链前导序列PTEN-L（lightchain leader PTEN-L，lclPTEN-L）递送至邻近的成胶质细胞瘤细胞。此工程化版本解决了胶质母细胞瘤中由于血-脑脊液屏障引起的药物吸收障碍的问题，并且稳定了PTEN-L前导序列的细胞间转移能力，发挥了细胞介导的蛋白质递送的潜力。

4 PTEN-L在肿瘤治疗中的探索

4.1 PTEN-L和tGAS 1的联合肿瘤抑制作用

PTEN的表达产物为双特异性磷酸酶，具有肿瘤抑制的作用，通过使PIP3去磷酸化来抑制PI3K的活性，还可以独立于PI3K调节细胞外调节蛋白激酶 1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2），是最重要的肿瘤抑制因子之一[26-28]。特异性生长抑制蛋白1（growth arrest-specific 1，GAS1）是一种分子量为37 kD的蛋白质，在神经胶质细胞瘤等多种肿瘤中呈过表达，可诱导细胞周期停滞和细胞凋亡[29]，并明显抑制胶质细胞源性神经营养因子（glial cell derived neurotrophic factor，GDNF）诱导的Tyr1062位点的RET的磷酸化，导致AKT磷酸化水平降低，促进B细胞淋巴瘤/白血病-2相关死亡促进因子（B cell lymphoma/leukemia-2 associated agonist of cell death，BAD）的去磷酸化和细胞色素C释放至细胞质中，激活caspase 9和caspase 3，进而诱导细胞凋亡，降低了ERK1/2的活性[30-32]。GAS1和PTEN均能够抑制PI3K/AKT和ERK1/2的活性，而且PTEN和GAS1过表达对肿瘤的抑制作用具有累加效应。tGAS1是一种截短的可分泌的GAS1，具有诱导细胞周期停滞和细胞凋亡及自分泌和旁分泌的优点，可诱导产生tGAS1的细胞及邻近肿瘤细胞凋亡，扩大GAS1的有效作用范围[32-34]，此特点与PTEN-L相似。有研究显示，通过慢病毒载体同时过表达等量的tGAS1和PTEN-L[35]，比单独表达tGAS1和PTEN-L更能有效地抑制U87的生长，且优于GAS1和PTEN的抑制肿瘤的作用，降低了AKT和ERK1/2的活性[36]。tGAS1和PTEN-L联合应用的效果优于单独应用，表明它们在诱导肿瘤细胞凋亡方面具有累加效应。

4.2 肝细胞癌

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染是发生肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的危险因素。在HCC中经常存在PTEN的突变与缺失。研究表明，PTEN-L过表达后可以抑制HCV的复制。重要的是，细胞外PTEN-L蛋白质能够以剂量依赖的方式抑制HCV的复制。脂质磷酸酶活性丧失的G129E突变体可以如野生型PTEN一样有效地抑制HCV的复制，而蛋白磷酸酶活性丧失的Y138L和蛋白、脂质磷酸酶活性丧失的C124S突变体无法抑制HCV的复制[37]。将PTEN的某些点突变转移至PTEN-L中的相应位置，结果显示，C297S和Y311L突变的PTEN-L蛋白不能抑制HCV的复制，但是，G302E突变的蛋白具有与野生型PTEN-L相同的抑制效应。结果表明，PTEN和PTEN-L中的3种氨基酸的功能在抑制HCV复制过程中是保守的，HCV核心蛋白通过第50位的精氨酸残基与PTEN相互作用从而发挥对HCV复制的抑制效应[37-38]。有研究显示，PTEN-L可通过PI3K/AKT途径抑制HepG2肝癌细胞的生长[39]。

通常认为通过腺病毒将PTEN的cDNA重新引入PTEN基因缺陷的患者体内，可以抑制因PI3K/AKT信号转导通路过度活化导致的肿瘤发生[40]，但是，腺病毒介导的基因治疗存在安全隐患，有相当一部分患者出现了由腺病毒导致的不良反应。因此，PTEN-L蛋白治疗可以避免因腺病毒介导所引起的不良反应，而且PTEN-L具有与内源性蛋白质相同的氨基酸序列，避免了免疫原性的发生风险[41-42]。

4.3 肾透明细胞癌

PTEN-L在肾透明细胞癌的发展中起着重要的作用。有研究发现，与癌旁正常肾组织相比，肾透明细胞癌组织中PTEN-L的表达水平明显降低，磷酸化的 AKT（phosphorylated AKT，pAKT）的表达水平明显升高，二者的表达水平呈负相关（P＜0.05）。在PTEN和PTEN-L的脂质磷酸酶活性的作用下，与相应的正常肾组织相比，肾透明细胞癌组织中pAKT的表达水平几乎增加了两倍。PTEN-L活性的下降导致PI3K/AKT信号转导通路被激活，AKT磷酸化水平升高，进而激活一系列下游信号转导通路，促进了肿瘤的发展。另外，该研究通过脂质体转染，使PTEN-L在肾透明细胞癌细胞786-0中过表达后阻断PI3K/AKT信号转导通路，从而抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，最终诱导肿瘤细胞发生凋亡。将PTEN、PTEN-L纯化蛋白质加入到无PTEN活性的肾癌细胞786-0的培养基中，PTEN-L蛋白可进入细胞内，通过其脂质磷酸酶活性抑制细胞内信号的传导，抑制PI3K/AKT信号转导通路，并诱导细胞凋亡；但PTEN蛋白并无这样的效果，并且PTEN-L纯化蛋白质可抑制异种移植瘤小鼠模型中786-0细胞的增殖，表明PTEN-L能够作为蛋白质治疗剂在体内及体外发挥肿瘤抑制的作用[43]。

4.4 胶质细胞瘤

PTEN-L在人脑胶质瘤中发挥着重要的作用。U87是无PTEN活性的人脑胶质瘤细胞，避免了内源性PTEN在细胞中的干扰。有研究发现，采用CRISPR/Cas9基因编辑工具结合单链模板，将编辑PTEN-L的起始密码子CTG改为ATG，在转染的全细胞裂解物和浓缩的细胞培养基中，通过Western blot可检测到PTEN-L的表达，而且与野生型U87或对照培养基相比，PTEN-L过表达可以降低AKT的磷酸化水平，抑制U87细胞的增殖。表明PTEN-L可以以旁分泌的方式进入邻近细胞以阻断PI3K/AKT信号转导通路，从而抑制U87细胞的增殖[42]。因此，对于不表达PTEN或携带基因突变的一些肿瘤细胞，可以在其他细胞中促进PTEN-L的表达，从而诱导肿瘤细胞发生凋亡。

5 问题与展望

PTEN-L具有双特异性磷酸酶活性，其表达产物可抑制多种肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移等，并可通过阻断PI3K/AKT信号转导通路发挥肿瘤抑制作用，但其他分子机制有待进一步深入研究。虽然在异种移植瘤小鼠模型中证实了PTEN-L的治疗效果，但仍应建立一种前瞻性动物模型[43]，即构建PTEN-L缺失的动物模型，通过与PTEN-L正常表达的动物模型进行对比，研究PTEN-L缺失与肿瘤发生、发展的关系，从病因学的角度探索PTEN-L的肿瘤抑制作用。

有研究显示，通过直接在肿瘤内注射慢病毒载体可以使tGAS1和PTEN-L过表达。tGAS1和PTEN-L从细胞中被释放出来后通过自分泌和旁分泌的形式扩大了GAS1和PTEN的治疗范围[36]。由于蛋白质的产生和释放发生于肿瘤内，因此认为它们在肿瘤外发生扩散并引起不良反应的发生率很低。但腺病毒介导的基因治疗存在安全隐患，会发生不同程度的不良反应。因此，目前通过以具有肿瘤细胞归巢能力的神经干细胞为载体来表达PTEN-L从而发挥治疗疾病的作用，减少不良反应的发生风险。虽然PTEN-L前导序列赋予了PTEN-L直接递送蛋白质的能力，但PTEN-L的细胞间转移能力不稳定，用人轻链IgG的前导序列替换PTEN-L的天然前导序列可增强细胞的分泌和转移能力，并且可稳定PTEN-L前导序列的细胞间转移能力，优化细胞介导的蛋白质递送能力[22]。因此，目前通过以神经干细胞为载体表达人轻链IgG前导序列的PTEN-L成为目前的研究趋势和重点。

除此之外，PTEN-L的蛋白磷酸酶活性也在肿瘤的发生、发展中起着重要的作用，研究表明，PTEN-L可以使pSer65-Ub去磷酸化，该过程抵消了PINK1介导的泛素磷酸化，从而发挥抑制线粒体自噬的作用。PTEN-L的这种新功能为解决控制线粒体自噬这一问题提供了思路，为涉及此过程的疾病（包括神经退行性疾病）的治疗提供了方向[44]，但仍需进行相关具体机制的探索，为临床治疗提供依据。PTEN还可以发挥炎性介质的作用，而对于PTEN-L是否具有此类作用及其相关机制尚不完全清楚。综上所述，PTEN-L不仅在肿瘤的治疗中发挥着重要的作用，在其他相关疾病的治疗中也具有重要的意义。PTEN-L其他的生物学特性及调控机制仍需进一步研究，其可能是基因治疗的优势潜在靶点。