氨基葡萄糖对小鼠实验性过敏性结膜炎的治疗作用△

赵梦帆 李兵

过敏性结膜炎是一种常见的眼表过敏性疾病，主要包括Ⅰ型和Ⅳ型变态反应[1]。近年来随着环境的变化发病率逐年上升，甚至有报道称发病率达到40%，并常伴发过敏性鼻炎、过敏性哮喘等疾病，对患者日常生活影响较大[2]。因其发病率高、易反复发作、治疗效果不理想等原因，现已成为眼科难治性疾病之一[3]。目前过敏性结膜炎的治疗方法有使用细胞膜稳定剂、免疫抑制剂、抗组胺药物以及特异性免疫治疗等，但均不能彻底治愈该病[4]。

氨基葡萄糖是一种天然氨基单糖衍生物，在临床上常用来治疗风湿性及类风湿性关节炎，也是一种常用的膳食补充剂。近年来，国内外学者研究发现，葡萄糖胺有明显的抗过敏作用，在小鼠过敏性哮喘、过敏性鼻炎、皮炎及小鼠葡萄膜炎等疾病中的作用都得到了证实[5]，但在过敏性结膜炎方面的研究较少，本文旨在研究氨基葡萄糖对小鼠实验性过敏性结膜炎的治疗作用，为过敏性结膜炎的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物与分组取6～8周龄雌性Balb/c小鼠40只(40眼)，体质量18～22 g(购于锦州医科大学)，置于SPF级实验室饲养；随机分为5组：空白对照组、过敏性结膜炎组、氨基葡萄糖腹腔注射组、氨基葡萄糖滴眼组、地塞米松治疗组，每组8只。

1.1.2主要试剂和仪器氨基葡萄糖盐酸盐、卵清蛋白(北京索莱宝生物科技有限公司)，氢氧化铝佐剂(美国Thermo公司)，地塞米松磷酸钠滴眼液(武汉五景药业)，ELISA试剂盒(上海依科赛生物科技公司)；酶标仪、超净工作台、裂隙灯显微镜。

1.2方法

1.2.1小鼠过敏性结膜炎模型制作从造模开始第0天和第7天，将100 μg卵清蛋白与200 μL氢氧化铝佐剂按照体积比12的比例完全混合，除空白对照组外，其余各组用混合液进行腹腔注射；第15～18天，给予250 μg的卵清蛋白滴眼激发。空白对照组在致敏和激发阶段均用等量生理盐水替代[6-7]。

1.2.2药物治疗及观察于造模开始后第15～18天，每次滴眼激发后30 min开始进行药物干预治疗，连续4 d。其中，氨基葡萄糖腹腔注射组每天1次给予氨基葡萄糖10 mg腹腔注射治疗，氨基葡萄糖滴眼组每天4次给予50 mg·mL-1氨基葡萄糖溶液50 μL滴眼治疗，地塞米松治疗组每天4次给予地塞米松磷酸钠滴眼液滴眼治疗，每天观察小鼠临床症状。

1.2.3临床症状评估、取材及标本制备末次激发后30 min内，裂隙灯显微镜下观察小鼠眼部临床症状，观察指标包括结膜水肿、结膜充血、眼睑充血水肿、流泪及眼部分泌物。用100 g·L-1水合氯醛麻醉后，眼球取血，提取血清用于ELISA检测；取下小鼠结膜用于制作病理切片并进行HE染色；无菌条件下取小鼠脾脏，分离脾细胞进行培养，检测上清液中炎症因子含量。

1.2.4病理学检测末次激发后30 min内，将眼球连同穹隆部结膜一同取下，40 g·L-1多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋，3 μm厚矢状位连续切片，每只眼球取不同层面的5张切片进行HE染色，中性树胶封片，镜检。每张切片在400倍光学显微镜下随机观察5个视野，并进行嗜酸性粒细胞计数。

1.2.5血清中IgE水平检测末次激发后30 min内，100 g·L-1水合氯醛麻醉小鼠，眼球取血，室温静置2 h后存于4 ℃冰箱过夜，离心后取上层血清，间接ELISA法测定血清中IgE水平。用已知浓度的标准品绘制标准曲线，加入小鼠血清后室温静置2 h，洗板5次，加入生物素标记的抗体和酶结合物的混合液，室温孵育1 h，洗板5次后，加入显色底物，避光孵育15 min，加入终止液，混匀后立即在酶标仪450 nm处读取吸光度(A)值。

1.2.6脾细胞培养及上清液炎症因子检测将小鼠脾脏无菌条件下分离，研磨并用无菌滤网过滤，RPMI1640培养基进行重悬，接种在96孔培养板内，细胞密度为10×106～20×106个·mL-1，每孔50 μL，每孔加入卵清蛋白至终浓度为100 g·L-1。培养96 h后，收集细胞培养上清液，ELISA法检测其中IL-4、IL-5、IFN-γ的含量[8-9]。

1.3统计学分析采用SPSS 21.0对实验数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1临床症状评估结果末次激发后30 min，观察小鼠临床症状。空白对照组无明显的过敏症状。过敏性结膜炎组小鼠出现明显的过敏症状，眼睑严重充血水肿，睁眼困难，结膜严重充血、水肿，流泪不止，眼部分泌物较多。氨基葡萄糖腹腔注射组、氨基葡萄糖滴眼组和地塞米松治疗组小鼠均能观察到较轻的眼睑肿胀、结膜少量充血水肿、流泪和少量眼部分泌物。见图1。

2.2病理学检测结果高倍镜下5组小鼠结膜嗜酸性粒细胞计数，总体差异有统计学意义(F=66.766，P=0.000)。各组间两两比较，氨基葡萄糖滴眼组嗜酸性粒细胞数与地塞米松治疗组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；氨基葡萄糖腹腔注射组与氨基葡萄糖滴眼组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。其余各组间两两比较，差异均有统计学意义(均为P<0.01)。过敏性结膜炎组嗜酸性粒细胞数均高于其他组。见表1和图2。

图1 卵清蛋白滴眼激发后各组小鼠眼部过敏症状。A：空白对照组；B：过敏性结膜炎组；C：氨基葡萄糖腹腔注射组；D：氨基葡萄糖滴眼组；E：地塞米松治疗组

图2 小鼠结膜HE染色(箭头示嗜酸性粒细胞，×400)。A：空白对照组；B：过敏性结膜炎组；C：氨基葡萄糖腹腔注射组；D：氨基葡萄糖滴眼组；E：地塞米松治疗组

2.3血清IgE含量检测结果各组小鼠血清IgE含量，总体差异有统计学意义(F=1253.780，P=0.000)。各组间两两比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)。过敏性结膜炎组血清IgE含量高于其他各组，氨基葡萄糖滴眼组血清IgE含量低于地塞米松治疗组，高于氨基葡萄糖腹腔注射组，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。见表1。

2.4脾细胞培养上清液炎症因子检测结果各组小鼠间脾细胞培养液上清液中的IL-4、IL-5和IFN-γ的表达水平，总体差异均有统计学意义(F=691.984，P=0.000；F=88.112，P=0.000；F=717.670，P=0.000)。各组间两两比较，氨基葡萄糖腹腔注射组上清液IL-5水平与地塞米松治疗组相比差异无统计学意义(P>0.05)；氨基葡萄糖腹腔注射组、氨基葡萄糖滴眼组、地塞米松治疗组及过敏性结膜炎组IFN-γ水平两两比较差异均无统计学意义(均为P>0.05)；过敏性结膜炎组IL-4、IL-5表达水平均高于其余各组；氨基葡萄糖滴眼组IL-4、IL-5表达水平均高于氨基葡萄糖腹腔注射组；空白对照组IFN-γ表达水平均高于其余各组，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。见表2。

表1各组小鼠结膜嗜酸性粒细胞数及血清IgE含量

组别眼数嗜酸性粒细胞数/个血清IgE含量/ng·L-1空白对照组87.13±4.05131.41±19.71过敏性结膜炎组844.00±6.97∗1028.43±37.03∗氨基葡萄糖腹腔注射组820.13±3.04△191.76±23.84△氨基葡萄糖滴眼组819.13±2.90△226.70±25.99△地塞米松治疗组818.25±5.18△311.67±36.74△

注：与空白对照组相比，*P<0.01；与过敏性结膜炎组相比，△P<0.01

表2脾细胞培养液上清液中的IL-4、IL-5和IFN-γ表达水平

组别眼数表达水平/ng·L-1IL-4IL-5IFN-γ空白对照组813.62±5.963.72±0.9333.32±0.54过敏性结膜炎组8279.08±17.7313.34±1.449.56±1.44氨基葡萄糖腹腔注射组8112.12±8.528.08±0.939.55±0.94氨基葡萄糖滴眼组8155.64±8.5010.44±0.979.73±0.85地塞米松治疗组851.34±4.468.43±0.959.33±1.53

3 讨论

过敏性结膜炎主要包括Ⅰ型和Ⅳ型变态反应，免疫学机制比较复杂。严重的过敏性结膜炎主要由浸润的嗜酸性粒细胞介导，活化的肥大细胞释放细胞因子刺激嗜酸性粒细胞脱颗粒产生白三烯、细胞因子等，对组织细胞有毒副作用，引发组织细胞重大损伤[10]。另外，过敏性结膜炎的发生发展还与Th1/Th2细胞因子表达失衡密切相关，表现为Th2型细胞因子优势表达，Th1型细胞因子分泌减少，平衡向Th2方向偏移[11]。Th2型淋巴细胞可以分泌IL-4、IL-5等细胞因子，激活肥大细胞及嗜酸性粒细胞，从而导致过敏性疾病的发生发展[12]。IL-4通过刺激IgE的基因重组和mRNA的转录，增强IgE的产生，使免疫系统对小量抗原刺激发生免疫应答。IL-5通过介导嗜酸性粒细胞的成熟来诱导免疫反应。Th1型淋巴细胞主要产生IFN-γ，IFN-γ是巨噬细胞活化必不可少的抗炎因子，能够抑制IL-4诱导的IgE的合成，从而参与过敏反应[13-14]。检测 IL-4、IL-5可以了解Th2的功能状态，检测IFN-γ可以了解Th1的功能状态。

目前过敏性结膜炎的治疗方法主要有应用细胞膜稳定剂、免疫抑制剂、抗组胺药物以及特异性免疫治疗等，单用抗过敏药物效果不佳且易复发，激素治疗副作用多，长期应用还可能造成严重后果。因此，研发安全有效的抗过敏、抗炎药物将是治疗过敏性疾病的方向之一。

氨基葡萄糖是一种天然氨基单糖衍生物，具有抗炎、抗肿瘤[15]、抗过敏、降脂、降血压等多重机制，在临床上是治疗风湿性及类风湿性关节炎的药物，对许多炎症和过敏性疾病的多个环节都有干预作用[16]。近年来，经过国内外学者研究发现，氨基葡萄糖在治疗过敏性疾病方面有显著疗效。研究证实，氨基葡萄糖在小鼠过敏性鼻炎中有显著疗效，能有效改善临床症状，显著降低过敏性鼻炎小鼠体内特异性IgE含量[17]。另有研究证明，在过敏性皮炎中氨基葡萄糖也有类似的抗过敏效果[18]。Collins等[19]研究发现，N-乙酰-D-氨基葡萄糖聚合物可下调Th2反应。Kim 等[20]报道环孢霉素/葡萄糖胺联合治疗有明显的降低血清IgE和Th2型细胞因子IL-4、IL-5和IL-13的作用，比单用环孢霉素治疗效果更显著。另外，氨基葡萄糖是一种安全性很高的药物，对肝功能和胃肠道的损伤很小，而且很少有哮喘恶化或立即过敏的病例发生[21]。

本研究中，我们将氨基葡萄糖应用于实验性过敏性结膜炎小鼠，结果显示过敏性结膜炎组临床症状较空白对照组明显，结膜嗜酸性粒细胞数和血清IgE表达水平均较空白对照组明显增高，说明成功建立了过敏性结膜炎小鼠模型。氨基葡萄糖腹腔注射组和氨基葡萄糖滴眼组临床症状较过敏性结膜炎组轻，结膜嗜酸性粒细胞数和血清IgE表达水平均显著低于过敏性结膜炎组，这表明氨基葡萄糖可以改善过敏性结膜炎小鼠的眼部过敏症状，降低小鼠体内的IgE水平，减轻嗜酸性粒细胞聚集。氨基葡萄糖滴眼组的嗜酸性粒细胞数与地塞米松治疗组相比差异无统计学意义，血清IgE表达水平与地塞米松治疗组相比明显降低，说明氨基葡萄糖滴眼治疗在减轻嗜酸性粒细胞聚集和降低血清IgE表达方面有很好的作用，其治疗效果优于地塞米松。氨基葡萄糖腹腔注射组与氨基葡萄糖滴眼组相比，嗜酸性粒细胞数差异无统计学意义，血清IgE表达明显降低，这表明氨基葡萄糖腹腔注射在降低血清IgE表达方面明显优于滴眼治疗，原因可能与药物的有效浓度相关，需做进一步探讨。从小鼠脾细胞培养上清液的检测结果来看，过敏性结膜炎组脾细胞培养上清液的IL-4、IL-5表达水平相对于空白对照组明显增高，IFN-γ表达水平相对于空白对照组明显降低，这提示过敏性结膜炎组中Th1/Th2平衡向Th2方向偏移。氨基葡萄糖腹腔注射组和氨基葡萄糖滴眼组，脾细胞上清液中Th2型细胞因子(IL-4、IL-5)表达水平相对于过敏性结膜炎组明显降低，但Th1型细胞因子(IFN-γ)表达水平相对于过敏性结膜炎组无明显改变，提示应用氨基葡萄糖有助于扭转过敏性结膜炎中Th1/Th2表达失衡，使其重新平衡，从而抑制过敏反应，对过敏性结膜炎起到一定的治疗作用，而这种作用主要是通过降低Th2型细胞因子的表达来实现的，对Th1型细胞因子的表达影响不大。

综上所述，氨基葡萄糖可以明显改善过敏性结膜炎小鼠的过敏症状，减轻结膜嗜酸性粒细胞聚集，降低血清中IgE的表达含量。其作用机制可能是通过降低Th2型细胞因子的表达，进而使过敏性结膜炎中失衡的Th1/Th2表达重新建立平衡而实现的。氨基葡萄糖作为临床的一种常用药，有较高的安全性和较低的副作用，有望成为治疗过敏性结膜炎的一种新的药物。