雷公藤甲素对中国仓鼠卵巢细胞凋亡的影响及黄体酮的干预效果▲

刘宴娟 祁爱蓉 路 遥 李顺民

(1 广州中医药大学第四临床医学院肾病科，广东省深圳市 518033，电子邮箱：851534964@qq.com；2 南方医科大学深圳医院肾内科，广东省深圳市 518033)

雷公藤提取物因具有糖皮质激素样药理作用而无激素样副作用[1]，而被广泛用于治疗肾脏疾病及多种免疫性疾病，且疗效显著[2]。但其有较高的生殖毒性，发生率达14.1%～22.5%[3-4]，其生殖毒性可导致女性月经不调，甚至闭经。研究表明，对于在育龄期接受雷公藤治疗的女性患者，早期应用雌孕激素干预治疗可保护其卵巢功能。黄体酮作为卵巢分泌的孕激素，可改善雌激素水平和黄体功能，治疗药源性闭经[5]。本研究通过采用雷公藤甲素干预体外培养的仓鼠卵巢细胞，观察细胞凋亡程度，探讨其对细胞凋亡的作用机制，同时观察黄体酮对雷公藤甲素所致仓鼠卵巢细胞凋亡的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验试剂及仪器 中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞(上海中科院细胞库，批号：GNHa3)，杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM；美国Gibco公司，批号：C11995500BT)，胎牛血清(杭州四季青公司，11011-8611)，青霉素-链霉素溶液(双抗；美国Gibco公司，批号：15140-122)，胰酶(美国Gibco公司，批号：12605-028)，杜氏磷酸缓冲液(Dulbecco′s phosphate-buffered saline，DPBS；美国HyClone公司，批号：SH30256.01)，膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素(annexin Ⅴ-fluorescein isothiocyanate，Annexin Ⅴ-FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)双染细胞凋亡检测试剂盒(凯基公司，批号：KGA108)，雷公藤甲素、黄体酮(纯度≥98%)均购自南京春秋生物工程有限公司(批号：38748-32-2、180522A)，兔抗试剂盒Ⅰ抗、Ⅱ抗(美国ProteinSimple公司，批号：PS-ST01-8、SM-W002-1)，细胞培养箱(三洋电机株式会社，型号：MCO-18AIC)，离心机(上海卢湘仪离心机，型号：TDZ4-WS)，流式细胞仪(美国BD公司，型号：Accuri C6)，蛋白印迹仪(美国ProteinSimple公司，型号：WesS/N:WS-2494)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞分组及培养：将CHO细胞接种于含10%胎牛血清及1%双抗的DMEM培养基中，随机分成对照组、黄体酮组、雷公藤甲素组和雷公藤甲素+黄体酮组，分别加入等量的DMEM培养液、0.05 μg/ml黄体酮、0.05 μg/ml雷公藤甲素、0.05 μg/ml雷公藤甲素+0.05 μg/ml黄体酮进行干预，每组设置3个复孔，其中雷公藤甲素、黄体酮临用时应用DMEM培养液稀释成所需浓度。将细胞置于37℃、5% CO2培养箱中培养，分别于干预后6 h、12 h收集细胞进行后续实验。

1.2.2 流式细胞术检测细胞凋亡：收集细胞，在20℃下1 500 r/min 离心5 min；加入500 μl DPBS沉淀洗涤细胞1 min；加入500 μl缓冲液重悬细胞；加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，混匀；室温下避光孵育15 min；1 h内上机检测，按常规标准判定结果。

1.2.3 蛋白印迹法检测细胞外信号调控的蛋白激酶磷酸化水平及即早基因c-fos表达水平：收集细胞后应用裂解液裂解30 min，冰上进行操作。收集裂解后的细胞到EP管，蛋白定量法测定细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、即早基因c-fos蛋白水平，95℃～100℃煮沸5 min，即为样本蛋白。每个泳道加入蛋白样品10 μg，经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳后，利用湿法将蛋白转移至膜上，用含5%脱脂奶粉封闭1 h，分别加入对应Ⅰ抗4℃孵育过夜，洗膜3次后，加入对应Ⅱ抗室温摇床孵育2 h，洗膜3次，发光显影，定影后进行分析。

1.3 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析面。计量资料以(x±s)表示，比较采用t检验或方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 4组CHO细胞凋亡率比较 干预后6 h，雷公藤甲素组、雷公藤甲素+黄体酮组细胞凋亡率均高于对照组和黄体酮组(均P<0.05)，而雷公藤甲素+黄体酮组细胞凋亡率低于雷公藤甲素组(P<0.05)。干预后12 h，雷公藤甲素组细胞凋亡率高于对照组和黄体酮组(P<0.05)，但雷公藤甲素+黄体酮组细胞凋亡率与雷公藤甲素组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。雷公藤甲素组干预后6 h与12 h细胞凋亡率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，而雷公藤甲素+黄体酮组干预后12 h的细胞凋亡率低于干预后6 h(P<0.05)。见表1。

表1 4组CHO细胞凋亡率比较(x±s，%)

注：与对照组相比，*P<0.05；与黄体酮组相比，△P<0.05；与雷公藤甲素组相比，#P<0.05。

2.2 4组CHO细胞ERK磷酸化及c-fos蛋白表达水平比较 雷公藤甲素组的ERK磷酸化水平低于对照组，c-fos水平高于对照组(P<0.05)；黄体酮组的ERK磷酸化水平、c-fos水平均低于对照组(P<0.05)；雷公藤甲素+黄体酮组的ERK磷酸化水平、c-fos水平均低于对照组、雷公藤甲素组(P<0.05)，见图1。

3 讨 论

雷公藤又名断肠草，属卫矛科一年生藤本植物，具有免疫调节、抗炎等药理作用，临床主要用于治疗自身免疫性疾病，其疗效较好，但副作用也较多。雷公藤主要化学成分包括雷公藤二萜(如雷公藤甲素、雷公藤内酯酮)、三萜(如雷公藤红素、雷公藤内酯甲)和雷公藤生物碱(如雷酚内酯、雷公藤次碱)等。雷公藤甲素既是发挥药理作用的主要活性成分，也是主要的毒性成分。雷公藤甲素可通过扰乱正常的内分泌状态致相关因子含量变化从而引起一系列损伤，其中包括生殖系统损害，这限制了雷公藤制剂的临床应用[6-7]。本研究结果显示，干预后6 h、12 h雷公藤甲素组细胞凋亡率均高于对照组(均P<0.05)，且雷公藤甲素组6 h与12 h细胞凋亡率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，即随雷公藤甲素处理细胞时间延长，细胞凋亡率并不增加，提示雷公藤甲素可致CHO细胞凋亡，但并不具有时间效应。

蛋白磷酸化对外界信号具有级联放大作用，在胞内介导胞外信号时具有专一应答性,且调节速度快，其也是细胞外信号影响细胞基因表达调控的重要通路，对外界信号的持续反应起重要作用。活化的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通过磷酸化核转录因子、细胞骨架蛋白及酶类等参与调节细胞增殖、分化、转化及凋亡，而ERK为MAPK 家族的信号通路之一，包括ERK1和ERK2两个亚型。雌激素可激活细胞中MAPK的活性，并产生一系列的反应。c-fos是调控细胞对外界刺激进行快速反应的即早基因之一，其转录和翻译不需要新蛋白质的合成[8]。本研究结果显示，雷公藤甲素组ERK磷酸化水平较对照组降低，c-fos水平较对照组升高(均P<0.05)，提示雷公藤可能通过引起ERK/c-fos异常表达导致CHO细胞凋亡。

黄体酮作为卵巢分泌的孕激素，能够维持女性正常的生理周期，临床上常被用于治疗月经失调、功能性子宫出血、黄体功能不足、先兆流产和习惯性流产等[9-11]。研究表明，对于服用雷公藤的育龄期女性患者，早期应用雌孕激素类药物对保护卵巢功能有一定的疗效，其中黄体酮作为最常用的激素药物，可改善雌激素水平和黄体功能，治疗药源性闭经[12]。本研究结果显示，雷公藤甲素+黄体酮组干预后6 h的细胞凋亡率低于雷公藤甲素组(P<0.05)，且干预后12 h的细胞凋亡率低于干预后6 h(P<0.05)，说明黄体酮对雷公藤甲素所致CHO细胞损害具有保护功能。

综上所述，雷公藤甲素可致CHO细胞凋亡，可能与其引起ERK/c-fos异常表达有关，但延长雷公藤甲素处理细胞的时间并不增加细胞凋亡程度。黄体酮对雷公藤甲素所致仓鼠卵巢细胞损害具有保护功能。