阿尔茨海默病患者血清同型半胱氨酸、超氧化物歧化酶水平及其临床意义▲

梁庆华 何本进 韦 勇 利荣乔 秦娇琴

(广西壮族自治区江滨医院1 检验科，2 神经内科，南宁市 530021，电子邮箱：215656503@qq.com)

近年来，随着人口老龄化的加剧，阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)患病率呈现逐年攀升的趋势。该病的发病机制复杂，目前尚未完全明确。研究表明，维生素B6、维生素B12和叶酸缺乏可导致高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia，HHcy)，而在不同的AD模型小鼠中HHcy可增加β淀粉样蛋白(amyloidβ-protein,Aβ)的沉积，从而损害其认知功能；在AD患者中HHcy通过Aβ与纤维蛋白原之间的相互作用，使病情恶化，因此同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)被认为是AD的一个独立危险因素[1-3]。在体内代谢过程中Hcy可产生活性氧，增加氧化应激水平。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是机体内对抗氧化应激的抗氧化酶，Hcy和SOD水平可间接反映机体对抗氧化应激，清除自由基的能力。本研究分析AD患者血清Hcy和SOD的表达水平，探讨这两项指标与AD的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2016年1月至2018年3月在我院神经内科确诊为AD的患者100例作为AD组。纳入标准：(1)均符合美国国立神经病语言障碍卒中研究所-AD及相关疾病协会制定的诊断标准[4]：① 经临床神经心理检查及认知量表测试确定为痴呆；② 有两项或两项以上的认知功能缺损；③ 40～90岁之间发病。(2)无意识障碍；(3)记忆和其他认知功能进行性衰退；(4)不存在可导致记忆和认知功能进行性缺损的躯体疾病或其他脑部疾患。其中男49例，女51例，年龄62～90(75.5±7.2)岁。另选取同期健康体检者100例作为对照组，其中男55例，女45例，年龄60～88(73.8±7.0)岁。两组均排除记忆障碍、认知障碍以及精神病家族史者。两组性别、年龄比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 仪器与试剂：贝克曼库尔特公司AU5800型全自动生化分析仪；Hcy检测试剂盒(酶循环法)为北京九强生物技术股份有限公司生产(批号：18-0927)，SOD检测试剂盒(比色法)为福建福缘生物科技有限公司生产(批号：SOD-180611-04)；DNA浓度和纯度检测采用NanoDrop2000型超微量紫外-可见光分光光度计[赛默飞世尔科技(中国)有限公司，型号：NanoDrop2000c]。C1000型PCR扩增仪为美国Bio-Rad公司生产。Gel Doc 2000凝胶图像分析系统为美国Bio-Rad公司生产。DNA提取试剂盒(盐析法)购自北京康为世纪生物科技有限公司(批号：CW2087M)。HhaⅠ限制性内切酶购自宝生物工程(大连)有限公司(批号：CK16010)。

1.2.2 标本采集：抽取研究对象清晨空腹肘静脉血8 ml。5 ml置于无抗凝剂的红头管，静置15～20 min后离心10 min(3 500 r/min)，取上清液检测Hcy和SOD水平；其余3 ml置于乙二胺四乙酸-K2抗凝管，用于提取DNA，检测载脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)基因多态性。

1.2.3 相关指标检测方法：(1)采用全自动生化分析仪检测Hcy和SOD水平。(2)ApoE ε4等位基因检测采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)法。① 引物设计及合成：从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)或UCSC(https://genome.ucsc.edu/index.html)基因组数据库中获取ApoE基因DNA序列，使用Primer Primier 6.0软件进行引物设计，其中上游引物：5′-TCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCA-3′，下游引物：5′-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACACTGCCA-3′，扩增产物长度为227 bp，引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。② PCR扩增：反应总体积为20 μl，包括10 μl预混液(2×)、0.5 μl引物、2.5 μl基因组DNA模板、1 μl二甲基亚砜、6 μl双蒸水。反应条件为：95℃预变性5 min；95℃变性45 s，64℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环，72℃延伸5 min。③ 扩增产物限制性内切酶：酶切体系为20 μl，其中15 μl PCR扩增产物、2 μl缓冲液(2×)、0.3 μl HhaⅠ、以双蒸水补足至20 μl，37℃消化3 h。68℃ 20 min终止反应，酶切产物放置4℃冰箱，用于SDS-PAGE，分析ApoE基因多态性。同时随机抽取两组研究对象各50%的标本送北京天一辉远生物科技股份有限公司进行测序验证分析结果。

1.3 统计学分析 使用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，比较采用t检验；计数资料以例数或百分比表示，组间比较采用χ2检验；两变量相关性使用Pearson相关性分析；采用受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线分析Hcy、SOD诊断AD的价值。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组血清Hcy与SOD水平比较 AD组血清Hcy水平高于对照组，SOD水平低于对照组(均P<0.05)，见表1。

表1 两组血清Hcy与SOD水平比较(x±s)

2.2 各组ApoE ε4携带者与非ApoE ε4携带者血清Hcy及SOD水平比较 ApoE基因多态性分析结果显示，AD组有7例携带ApoE ε4基因，对照组有3例携带ApoE ε4基因。AD组中，ApoE ε4携带者与非ApoE ε4携带者血清Hcy水平差异无统计学意义(P>0.05)，ApoE ε4携带者血清SOD水平低于非ApoE ε4携带者(P<0.05)；对照组中，ApoE ε4携带者与非ApoE ε4携带者Hcy、SOD水平差异无统计学意义(均P>0.05)。AD组ApoE ε4携带者血清SOD水平低于对照组ApoE ε4携带者(P<0.05)，但两者血清Hcy水平差异无统计学意义(P>0.05)；与对照组非ApoE ε4携带者比较，AD组非ApoE ε4携带者血清Hcy水平升高，而血清SOD水平降低(均P<0.05)。见表2。

表2 两组ApoE ε4携带者与非ApoE ε4携带者血清Hcy及SOD水平比较(x±s)

2.3 AD组患者血清Hcy与SOD水平相关性分析 AD组患者血清Hcy与SOD水平呈负相关(r=-0.267，P=0.007)。

2.4 血清Hcy、SOD水平及联合检测诊断AD的价值 血清Hcy、SOD水平及其联合检测对AD均有一定的诊断价值，3者的曲线下面积比较，差异有统计学意义(Z=26.109，P<0.001)，其中SOD与联合检测的曲线下面积均大于Hcy(Z=8.269，P<0.001；Z=8.248，P<0.001)，单独SOD诊断AD的价值与联合检测的诊断效能相当(Z=0.515，P=0.606)，见表3及图1。

图1 Hcy、SOD及联合指标联合检测的ROC曲线

表3 Hcy、SOD及联合检测诊断AD的效能

检测指标曲线下面积P值灵敏度(%)特异度(%)Hcy0.6090.0073291SOD0.949<0.0019290联合检测0.949<0.0019290

3 讨 论

氧化应激可通过钙蛋白酶活化细胞周期素依赖性蛋白激酶5以激活Aβ前体蛋白裂解酶，从而增加Aβ沉积；或通过激活蛋白磷酸酶2A与糖原合成酶激酶3β，引起过度磷酸化的Tau蛋白发生沉积。而神经纤维缠结是AD的组织病理学特征之一，其主要由Aβ和过度磷酸化的Tau蛋白组成，因此氧化应激被认为是AD重要的发病机制之一[5]。研究发现，Hcy水平增高可引起Aβ沉积，损坏海马神经元的DNA修复，使之对Aβ毒性敏感，导致神经元死亡，进而使认知能力进一步下降；或引起过度磷酸化Tau蛋白大量沉积，使突触失活，从而导致神经退行性病变[6-8]。Hcy通过诱导氧化应激调节Aβ与Tau蛋白通路，从而在AD发展中扮演重要角色[9]。Hooshmand等[10]研究发现HHcy可增加老年人患AD的风险。多个临床研究发现Hcy水平升高是AD的独立危险因素[11-14]。本研究结果显示AD组血清Hcy水平高于对照组(P<0.05)，与上述研究结果相似。

SOD是一种反映人体内自由基代谢状态的重要抗氧化酶，在机体的氧化与抗氧化平衡中发挥很大作用，因此其水平高低可间接反映机体对抗氧化应激，以及清除自由基的能力。除了抗氧化活性外，SOD还有抗炎、抗癌和抗衰老等生物学特性，有学者认为其还可作为AD等疾病的诊断指标[15]。Vinothkumar等[16]研究发现，AD患者血浆SOD水平明显下降，而Aβ和脂质过氧化水平均升高。严旭东等[17]研究发现AD患者血清SOD水平低于健康体检者，且其水平与AD的病程及严重程度密切相关。此外，还有研究提示，使用SOD或具抗氧化活性的替代药物来对抗由Aβ、过度磷酸化Tau蛋白或HHcy等产生的氧化应激，不仅能显著降低Hcy及提高SOD水平，还可明显改善AD模型动物的学习记忆能力或AD患者的认知功能与日常生活能力[9，18-21]。本研究结果显示AD组SOD水平低于对照组，与上述研究结果相似。而ROC曲线分析结果显示，Hcy、SOD水平及其联合检测对AD均有一定的诊断价值，SOD单独诊断AD的价值与联合诊断效能相当(P>0.05)，笔者认为SOD可用于AD患者的辅助诊断。

ApoE基因具有多态性，其3个等位基因ε2、ε3、ε4可分别编码E2、E3、E4 3种异构体，产生E2/E2、E2/E3、E2/E4、E3/E3、E3/E4、E4/E4 6种遗传表型。AOPE基因型在正常人群中ε3/ε3最多见，ε2/ε2或ε4/ε4最少。目前认为ApoE ε4等位基因是散发性AD发展最重要的遗传危险因素。临床研究表明[22-25]，AD患者ApoE ε4频率高于健康老人，携带ApoE ε4的轻度认知障碍患者发展为AD的风险更高；ApoE ε4携带者比非携带者更容易患AD，且与ε4杂合子相比，携带ε4纯合子的人群更容易发生AD，且发病时间更早。还有学者发现携带ApoE ε4的AD患者海马区的氧化应激水平高于非携带者[26]，提示Apo Eε4可能通过诱导机体的氧化应激，引起Aβ大量聚集，使神经元产生毒性而死亡，从而增加AD的患病风险，但其具体作用机制仍未完全清楚。本研究结果显示，携带ApoE ε4与非ApoE ε4携带的AD患者间，以及携带ApoE ε4的AD患者与健康者间血清Hcy水平差异均无统计学意义(P>0.05)，这与Zverova等[11]的研究结果相似，提示AD患者血清Hcy水平可能与ApoE ε4基因型无关。而AD组中ApoE ε4携带者血清SOD水平低于非ApoE ε4携带者，AD组ApoE ε4携带者血清SOD水平低于对照组ApoE ε4携带者(P<0.05)，提示携带ApoE ε4的AD患者机体对抗氧化应激、清除自由基的能力明显下降。同时，本研究结果还显示，AD组患者血清Hcy与SOD水平呈负相关，提示AD患者Hcy水平升高可能诱导了机体的氧化应激，而机体在对抗氧化应激时，消耗了大量的抗氧化酶，致使SOD水平降低。

综上所述，AD患者血清Hcy水平升高，SOD水平降低，血清Hcy水平可能与AD遗传危险因素ApoE ε4无关，而SOD水平可能与ApoE ε4有关。血清SOD水平诊断AD的效能较高，可用于AD的辅助诊断。