核酸适配体分子信标探针在肿瘤研究中的应用进展△

黄晨，李婉明

中国医科大学卫生部细胞生物学重点实验室/医学细胞生物学教育部重点实验室/细胞生物学教研室，沈阳110122

分子信标在1996年由Tyaqi和Kramer[1]首次报道，有特殊的发夹结构，是一种新型荧光探针，具有背景信号低、操作简单、特异性识别强、灵敏度高，以及无需与未反应的探针分离即可实时检测等特点，因此近年来被广泛应用于生命科学研究的众多领域[2]。随着分子信标技术的发展和成熟，研究者已发展出多种新型分子信标，使分子信标的应用不再受限于核酸分子的杂交检测[3]。核酸适配体是可以折叠成明确三维结构并通过空间构型互补与靶分子结合的一段短的单链寡核苷酸序列（ssDNA或RNA），于1990年被Ellington和Szostak[4]与 Tuerk和Gold[5]首次利用指数富集配体的系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）筛选获得，因其具有靶分子广泛、特异性及亲和力强、稳定性好、变性复性快速可逆、易于化学修饰和标记等诸多优点，在生物医学领域受到广泛关注并显示出良好的应用前景[6-7]。本文对基于核酸适配体的分子信标探针在肿瘤研究中的进展进行简要综述。

1 分子信标的结构和原理

分子信标是一种特殊设计的具有茎-环（loopstem）结构的寡核苷酸探针，其中环部是目标识别区，通常由25～35个碱基组成；茎部由5～8个碱基互补序列组成，荧光基团和淬灭基团分别共价的连接在茎部的两个末端。当目标分子不存在时，两侧碱基配对形成双螺旋，使分子信标呈发夹型结构，继而使分别修饰在5'末端的荧光基团和3'末端的淬灭基团相互接近，二者之间发生能量转移（直接能量转移或者荧光共振能量转移），荧光几乎被淬灭。当目标存在时，分子信标的环部与目标结合，分子间强杂交作用力打开茎部螺旋，导致分子信标的构象改变，荧光基团和淬灭基团分离，二者之间的能量转移终止，荧光基团恢复荧光，且荧光强度与目标浓度呈正比[8]。但是，因为分子信标是一段核苷酸序列，易被核酸酶分解且容易与单链DNA结合蛋白非特异性结合，限制了其在临床生物学中的应用[9-10]。因此，设计生物稳定性和特异性高的分子信标，使其更好地应用于临床，具有重要的意义。

2 核酸适配体的结构和原理

核酸适配体是通过SELEX从随机寡核苷酸库中筛选出来的，能与靶点特异性结合的寡核苷酸（DNA或RNA）序列。核酸适配体的靶点类型非常广泛，包括酶、核苷酸、抗体、转录因子、生长因子、多肽、氨基酸、抗生素、有机染料及重金属离子，甚至完整的病毒和病原体以及完整的细胞[11]。核酸适配体本质上是由一段单链核酸分子折叠成的特殊三维结构，如发夹（hairpin）、内环（internal loops）、假结（pseudoknot）、凸环（bulge）、G-四聚体（G-tetramer）等，与靶点高亲和力、高特异性结合[12]，被称为“化学抗体”。与蛋白抗体相比，核酸适配体具有亲和力及特异性高、合成简单、相对分子质量低、化学结构稳定性高、不良反应少、免疫原性低和便于修饰多种功能基团或材料等优点[13-14]。利用核酸适配体的分子识别特性，可设计多种针对不同类型靶点的核酸适配体分子探针，极大地扩展了核酸探针在生命科学研究领域的应用范围。

3 核酸适配体分子信标探针的设计

核酸适配体分子信标是将核酸适配体和分子信标结合起来的一种新型分子信标，其在分子信标的基础上，对核酸适配体进行合适的剪切、延长和合并，使核酸适配体融合到分子信标中，从而完成高效荧光探针的设计，它的出现极大地扩展了检测目标的范围并提高了检测的灵敏度[15-16]。核酸适配体分子信标的茎、环部分是由某种待检测物的核酸适配体构成。核酸适配体在分子信标的设计中作为识别单元，结构灵活，与靶点作用后其结构可发生改变或重构，是实现信号转导的理想选择[17]。这类分子信标的优点首先在于只要筛选出目标物的核酸适配体，就可以设计出相应的分子信标并对其进行检测；其次，核酸适配体的靶点类型广泛，以其为基础设计的分子信标的应用范围也广泛，在各领域都具有良好的应用前景；最后，核酸适配体对靶点具有高亲和力与高特异性，因此可以明显提高被检测靶点的灵敏度和选择性。Hamaguchi等[18]通过延长核酸适配体的一端使其自杂交形成发夹结构，构建了一种靶向凝血酶的检测下限可达10 nmol/L的核酸适配体分子信标探针。Yamamoto等[19]发展了一种“拆分型”的核酸适配体分子信标探针，当目标蛋白的浓度为200 nmol/L时，荧光强度增强约14倍，可实现对目标蛋白的高灵敏检测。

4 核酸适配体分子信标探针在肿瘤中的应用

近年来，SELEX筛选技术不断发展和完善，逐步筛选出越来越多的核酸适配体，核酸适配体分子信标探针为生物成像领域，尤其是肿瘤领域的发展提供了大量性能优异的分子研究工具。

4.1 体内核酸的分析和检测

细胞内特定mRNA的表达水平和亚细胞分布可以很好地反映生物体内的遗传程序和应激反应，对细胞内mRNA的监测和检测可为生物学研究、医学诊断及治疗、药物开发等提供有价值的信息[20]。经典的分子信标是一种性能优异的核酸分子检测工具，但是分子信标本质上也是核酸，作为一种带负电荷的亲水性生物大分子，难以跨越同样带负电荷的细胞膜，很大程度上限制了其在生物体内的应用[21]。某些功能性核酸适配体具有细胞特异性内化功能，可作为靶向肿瘤细胞的输送载体，以其为基础设计的分子信标探针，可实现活细胞的靶向穿膜[22]。Qiu等[23]将靶向核仁素的核酸适配体SA1411作为靶向输送内化载体，成功地将分子信标高效地输送到乳腺癌MCF-7细胞的细胞质中，并利用光照调控，既控制了分子信标的细胞内化功能，又实现了细胞质内靶点mRNA的高时空监测和追踪。Ying等[24]设计了一种新型Light-up RNA适配体传感器，成功用于活体内肿瘤细胞微小RNA（microRNA）的定量检测，实现了体内肿瘤细胞的可视化和高灵敏检测，这为其在肿瘤细胞中功能的阐明提供了可能性。

4.2 蛋白质的检测

核酸适配体具有与靶点结合力强、特异性高、可体外合成、易功能修饰等诸多优点，在一定程度上弥补了抗体技术的不足。目前，运用SELEX已筛选出多种靶向蛋白质的核酸适配体，大部分为肿瘤相关标志物，并被广泛应用于基础研究和临床诊疗[25]。利用核酸适配体的特性，无需分离洗脱样品就可以快速、实时测定组分中的靶蛋白，这使其在肿瘤的早期诊断、临床用药等方面具有更重要的应用价值。血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）是一种具有诱导肿瘤新生血管形成以及直接或间接地促进肿瘤细胞的增殖和迁移的促血管生长因子。Yang等[26]设计了芘标记的核酸适配体分子信标探针，并对PDGF进行检测，此探针在细胞培养基中对PDGF的检测极限可达10-12mol/L级，可有效减少复杂基质中背景信号的干扰。Zhao等[27]也设计了一种靶向PDGF的核酸适配体分子信标探针，当探针结合PDGF时，核酸适配体发生构象改变，因其荧光基团相互靠近，发生荧光共振能量转移，产生荧光信号。将探针固定在间充质干细胞的细胞膜表面，实现了对外加的或相邻细胞分泌的PDGF高时空分辨的定量检测，并可在单细胞水平上对细胞迁移进行实时监测。

4.3 肿瘤细胞的成像

以完整活细胞为靶点的cell-SELEX筛选出的核酸适配体可直接用于靶细胞的识别，这为肿瘤的诊断和治疗提供了颇有潜力的分子识别成像探针[28]。Shi等[29]设计了一种可激活的核酸适配体分子信标探针（activatable aptamer probe，APP），用于靶向活体内肿瘤细胞的可视化检测。APP处于静止状态时，所带荧光基团被淬灭；当其结合靶点肿瘤细胞时，APP构象发生改变，荧光基团被释放，荧光被恢复。以核酸适配体sgc8为基础设计的APP，在200µl的样品中实现了118例人急性淋巴白血病细胞（CCRF-CEM细胞）的检出下限，有效地提高了肿瘤细胞检测的灵敏度，为提高肿瘤早期诊断的准确性提供了新方法；APP成功用于活体成像，有效减少了非靶组织部位的背景信号，并缩短诊断时间至15 min，显示出良好的靶细胞组织特异性。

及时进行肿瘤的诊断和肿瘤进展的监测具有重要的临床意义，尤其是对循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）的监测分析。Hwang等[30]设计了一种基于量子点（quantum dot，QD）同时靶向上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）和黏蛋白 1（mucin1，muc1）（QD-EpCAM/muc1）的核酸适配体分子信标探针，用于CTC的检测分析。在EpCAM/muc1不存在的情况下，该分子信标形成部分双环状结构并保持淬灭状态；在EpCAM/muc1与各核酸适配体结合时，触发分子信标构象改变，并释放绿/红荧光信号。QD-Ep-CAM/muc1核酸适配体分子信标探针成功地用于体外和体内EpCAM/muc1的监测和成像，为CTC的诊断提供选择性和特异性更高的分子工具。

5 小结与展望

核酸适配体作为“化学抗体”，具有独特的优势，其作为荧光分子探针在生化分析和生物成像领域有着广阔的应用前景，但其应用研究仍处于初级阶段，还有许多问题需要解决：①核酸适配体的筛选方法比较繁琐、耗时，目前被筛选出的核酸适配体数量非常有限，在一定程度上制约了核酸适配体的应用，急需开发更有效的筛选方法；②核酸适配体与靶点的结合信号模式，在一定程度上限制了检测的灵敏度；③体内的复杂环境体系以及核酸适配体容易被核酸酶降解等因素极大地限制了核酸适配体分子信标在体内的应用。目前核酸适配体分子信标的应用大部分仍然停留于基础研究阶段，且主要集中于常用的核酸适配体的研究，实际应用远不及蛋白抗体的普及。因此，如何克服以上局限性，进一步拓展核酸适配体分子信标在生命科学领域，特别是肿瘤领域的应用，需要科学工作者不断努力和突破。相信随着核酸适配体的发展，越来越多与不同靶点特异性结合的核酸适配体将被筛选出来，基于核酸适配体的分子信标将在生命科学领域得到进一步的发展。