嵌合抗原受体T细胞在肿瘤免疫治疗中的研究进展

2019-03-14谭灏李祥康永刘聪杨伟晗

癌症进展 2019年4期

谭灏，李祥，康永，刘聪，杨伟晗

山西省中医药研究院方剂实验室，太原 030012 00

近年来，尽管放疗、化疗及手术治疗等常规肿瘤治疗方法可以起到一定的治疗效果，但肿瘤的转移、复发及患者生存率低等问题仍未得到妥善解决[1]。随着临床研究的深入开展，嵌合抗原受体T（chimeric antigen receptor transduced T，CAR-T）细胞疗法成为近年来肿瘤免疫治疗的新方法并逐渐成为解决上述难题的重要方法[2-3]。CAR-T细胞免疫治疗新策略给肿瘤患者带来新的希望[4]，但仍有不足之处。

常规抗肿瘤治疗的靶点位于肿瘤组织及细胞，但肿瘤免疫治疗的重点在于提高患者自身免疫力。CAR-T细胞作为个体化的“活药物”，结合T细胞杀伤作用和抗原抗体高亲和性，经基因转导使T淋巴细胞表达嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）后，在机体内识别肿瘤抗原，进而起到精确杀伤肿瘤细胞的作用。CAR-T细胞疗法在卵巢癌、淋巴瘤及白血病等[5-6]恶性肿瘤治疗中可以高效、准确地定位肿瘤靶点，疗效可靠。与单克隆抗体相比，CAR-T细胞具有更有效且持久的抗肿瘤效果。

1 CAR的主要结构

CAR结构包含3个部分，依次为细胞外抗原结合区、细胞内信号肽区及跨膜区。细胞外抗原结合区的主要作用是对靶细胞外表的特异性抗原进行特异性识别，并起着决定性作用。CD3、CD4及CD28等构成了CAR跨膜区。该区域包括单链可变片段和铰链区，其中单链可变片段是克服主要组织相容性复合体限制的关键，铰链区促进肿瘤相关抗原的选择。细胞内信号肽区的主要功能为信号转导。目前CAR的信号域大致分为3代，已经从第1代单信号分子发展到含有CD28、4-1BB和其他共刺激分子的多信号域（第2、3代），并被广泛应用于临床[7]。

2 CAR-T细胞的作用机制

1989年Gross等首次提出了建立CAR，将抗原抗体的高亲和性与T细胞的杀伤作用相结合，构建特异性CAR。通过一定途径将编码CAR的基因插入T细胞，使T细胞表达该抗体[8]。经一系列免疫反应修饰T细胞，再通过体外扩增及纯化后重新输入机体内。组建的CAR-T细胞不仅可以特异性识别肿瘤抗原，还可以与其有效结合，进而发挥更强的杀伤作用。在基因修饰的作用下，T细胞可以起到靶向杀伤的作用。肿瘤局部免疫微循环不仅不会对其进行抑制，还可以影响宿主免疫耐受，最终对肿瘤细胞起到特异性杀伤效果[9]。CAR-T细胞有3代，尽管第1代可以对肿瘤细胞进行识别，但仅表现为诱导细胞活化[10]，且其分泌的细胞因子水平过低，无法取得持久的抗肿瘤效应和T细胞增殖作用。为了使T细胞获得更好的活化效果，第2代CAR-T细胞重组了共刺激分子，将CD28、CD137等置入CAR-T细胞中。一方面明显增强了肿瘤相关抗原的活性；另一方面加速了白细胞介素-2的分泌，增强了T细胞的活化及增殖，起到杀伤肿瘤细胞的效果。在第3代CAR-T细胞中，CAR细胞内信号肽区多加入了两个共刺激分子。与第2代对比，体外实验结果显示其抗肿瘤效应更强。尽管第3代CAR增强磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）信号通路活性[11]，上调抗凋亡蛋白表达，强化T细胞活化、增殖，但共刺激分子较强时会导致细胞因子风暴以及信号泄露。除此之外，其还会下调信号转导阈值，造成未获得抗原刺激下激活T细胞，最终杀伤邻近正常组织细胞。目前，CAR技术已发展到第4代，在血液肿瘤和实体肿瘤治疗中取得了一定的效果。

3 CAR-T细胞在临床治疗中的应用

常规肿瘤治疗方法如手术治疗、化疗等的不良反应给患者身心带来沉重的负担。而CAR-T细胞疗法不会明显损伤正常细胞，仅对肿瘤细胞具有特异性杀伤作用，不良反应极少，因此可以提高患者的治疗依从性；同时CAR-T细胞还可以重建，增强患者的免疫功能，在抗肿瘤过程中发挥长效机制[12]。

CAR-T细胞可经单链抗体片段（single chain antibody fragment，scFv）可变区序列对肿瘤特异性抗原进行识别，再通过信号转导分泌颗粒酶、穿孔素等，同时表达肿瘤坏死因子及Fas配体（Fas ligand，FasL）蛋白相关的凋亡配体，促使肿瘤细胞逐渐凋亡。另外，CAR-T细胞需要冷冻保存，冷冻可减少细胞因子如干扰素γ、白细胞介素-2及肿瘤坏死因子α等的分泌，具有抗肿瘤的作用[4]。很多血液肿瘤均具备特异性抗原及单克隆抗体，可以为CAR-T细胞的构建提供有效的scFv可变区以及靶点。因此，在血液肿瘤治疗时CAR-T细胞应用广泛，如CD19、CD133[13]。

3.1 CAR-T细胞在B细胞恶性肿瘤中的应用

经CAR修饰的自体或异体来源的T细胞靶向B细胞恶性肿瘤抗原CD19的研究，构建了CAR-T-19慢病毒表达载体，培养CAR-T-19细胞扩增体系。先通过体外杀伤实验，后对9例患者进行临床研究，得出CAR-T-19细胞治疗难治、复发性小儿急性淋巴细胞白血病可获得有效的疾病缓解[14-15]，B细胞非霍奇金淋巴瘤是一种非常罕见的恶性肿瘤，以抗CD20为基础的化学免疫疗法的标准治疗对该病的控制非常有效。然而，标准疗法对双重打击淋巴瘤、转化型淋巴瘤或早期复发风险高的患者效果较差。过继性CAR-T细胞治疗是一项可以有效治疗预后不良的B细胞淋巴瘤患者的新技术[16]。在B细胞非霍奇金淋巴瘤治疗中靶向CD19的CAR-T细胞重定向免疫疗法成为一种新的选择，特别在难治、复发性非霍奇金淋巴瘤的Ⅰ期临床试验中取得较好的效果[17]。除治疗外，临床护理也至关重要。通过分析13例接受CAR-T细胞免疫疗法的B淋巴细胞血液恶性肿瘤患者的治疗效果，得出充分的治疗准备、积极的护理配合和并发症的处理是促进患者康复的关键[18]。采用Meta分析法检测CAR-T-19细胞治疗B细胞恶性血液疾病的临床疗效，得出靶向CD19的CAR-T细胞治疗B细胞恶性血液疾病的临床疗效显著[19-20]。

3.2 CAR-T细胞在白血病中的应用

在急性髓细胞样白血病（acute myeloid leukemia，AML）治疗中发现化疗耐药和复发仍然是患者死亡的重要原因。由于化疗药物通常诱导机体发生严重的组织急性坏死或长期不良反应，进一步强化常规细胞毒性药物化疗可能行不通。因此，肿瘤抗原重定向CAR-T细胞免疫治疗在复发或难治性B淋巴细胞白血病患者中发挥积极作用，成为AML患者的新精确药物治疗方法，可能提高白血病患者的缓解率并减少不良反应。治疗过程中选择最佳靶抗原，考虑不良反应缓解策略，以及规避潜在的CAR-T细胞耐药性，对高风险AML患者的细胞免疫治疗至关重要[21]。

CD19阳性的急性淋巴细胞白血病的有效治疗方法首选CAR-T细胞疗法。CAR-T细胞疗法不仅可以降低耐药患者体内肿瘤负荷，还可以提高疾病缓解率[22]，在血液恶性肿瘤治疗中具有良好的应用前景[23-24]。另外，使用氟达拉滨（fludarabine，FDR）及马磷酰胺（mafosfamide，MFA）改变细胞膜结构的方法可以诱导CAR-T-19细胞早期凋亡，这一机制奠定了化疗药物抑制CAR-T-19细胞作用的理论基础[25]。

3.3 CAR-T细胞在其他肿瘤中的应用

CAR-T细胞作为个体化的“活药物”，在白血病和淋巴瘤治疗中抗肿瘤效果显著[5]。除此之外，结合过继性免疫治疗的优势，有学者提出卵巢癌临床治疗的新方法和新策略。通过对人外周血单核细胞的感染，制备稳定表达的CAR-T细胞，使用免疫组织化学法和蛋白质印迹法检测卵巢癌样本及细胞系中间皮素（mesothelin，MSLN）表达及CAR-T细胞对MSLN阳性卵巢癌细胞的杀伤能力。抗MSLN CAR-T细胞可以特异、有效、安全地杀灭卵巢癌细胞，抑制肿瘤生长[26]。

尽管实体瘤治疗中CAR-T细胞疗法尚未纳入临床试验，但在动物模型实验中获得令人满意的抗肿瘤效果，如Wing等[27]将溶瘤病毒与过继性CAR-T细胞结合，提高了小鼠肿瘤模型的抗肿瘤效果，延长了其存活率，克服了CAR-T细胞作为实体瘤中单一疗法的关键限制。在通过异种胶质瘤裸鼠移植瘤模型检测靶向表皮生长因子受体Ⅲ型突变体（epidermal growth factor receptor typeⅢ variant，EGFRvⅢ）的CAR-T细胞对肿瘤的杀伤活性的研究中，体内肿瘤生长实验显示，靶向EGFRvⅢ的CAR-T细胞组肿瘤体积在注射后3周与绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）阳性T细胞组比较，差异有统计学意义（P﹤0.01）[28]。在CAR-T细胞中，自然杀伤受体2D可以促进诸多细胞因子的分泌，进而使卵巢癌细胞被溶解[29]。除此之外，在肺癌、神经母细胞瘤、神经胶质瘤及肝癌中，CAR-T细胞亦起到一定的抗肿瘤效果。

自首次报道CAR-T细胞起，它主要用于治疗肝硬化所致的腹腔积液。此外，CAR-T细胞也可以安全地应用于恶性肿瘤所致的腹腔积液。虽然尚无相关的证据，但CAR-T细胞可以作为一种治疗顽固性腹腔积液的预期策略[30]。Kawada等[31]对1例确诊胃癌[M，3型，cT4a（SE），cN0，cH0，cP1，cM1，C期Ⅳ]的患者进行CAR-T姑息治疗，随后是FLAST方案（5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸联合紫杉醇）化疗。经8个疗程治疗，无并发症发生，症状改善。患者最终生存时间约18个月，并可长期摄取正常饮食。

4 关于CAR-T细胞安全性的分析

4.1 细胞因子风暴

随着不断积累临床应用强效免疫治疗剂的经验，人们逐渐意识到其内在固有和潜在致命的不良反应，最严重的是细胞因子释放综合征（cytokine-release syndrome，CRS）[32]。CAR-T 细胞大量输注后，通过抗原的刺激，能够分泌大量的细胞因子，导致细胞因子风暴[33]，进而引起多器官功能衰竭与急性呼吸窘迫综合征。由此可见，多次且小剂量地输注CAR-T细胞具有重要意义，明确最安全且有效的CAR-T细胞的剂量可作为临床工作的重点。

4.2 免疫排斥反应

目前CAR-T细胞使用的scFv基本来源于鼠源性单克隆抗体。人源化单克隆抗体的制备可通过基因工程进行，并且其于CAR-T细胞外区整合可以减少不良反应。因此，人源化单克隆抗体的引入将使CAR-T细胞的应用范围再次扩大。

4.3 脱靶效应

CAR定向的靶抗原在正常组织中有不同程度的表达，因此CAR-T细胞与此类抗原结合会攻击正常组织[34]，造成免疫缺陷或者组织损伤。因此，建立CAR-T细胞识别靶抗原，可以使肿瘤靶向性得到提高，进而避免正常组织的损伤。

4.4 CAR-T细胞归宿

如果CAR-T细胞长期存在于体外而无法被清除，则会影响机体正常免疫应答反应。于CAR-T细胞中整合caspase 9自杀基因，对其激活并进行调控，可以有效清除CAR-T细胞。但是也有如单纯疱疹病毒胸苷激酶（herpes simplex virus-thymidine kinase，HSV-TK）会自身激活，造成CAR-T细胞的消耗并影响其杀伤肿瘤细胞的效果[24]。Fas分子和DR5通路是通过结合Fas-Fc和DR5-Fc重组蛋白阻断体内的CAR-T细胞起主导细胞凋亡的作用[35]。