柠檬苦素降解菌C6降解特性及活性降解酶的分离纯化

张锦华 ，臧三丽 ，白宝清 ，岳建伟 ，范三红

（1.山西大学生命科学学院，山西太原 030006；2.山西众智检测科技有限公司，山西太原 030006）

苦味问题一直是柑橘汁加工工业中亟待解决的关键性难题。有研究表明，柠檬苦素和柚皮苷是在柑橘类果汁生产中产生苦味的主要物质[1-4]。其中，柠檬苦素的苦味阈值很低，在水溶液中为1.0 mg/L，在果汁中约为3.4 mg/L，是柚皮苷苦味的20倍，且是引起果汁加工过程中产生后苦味的主要因素[5-6]。因此，研究改善柠檬苦素苦味的方法显得尤为重要。

柠檬苦素是一种三萜类植物次生代谢产物，主要存在于芸香科和楝科中[5]，在柑橘属植物中含量最为丰富，是柑橘加工中产生苦味的主要物质[7]。有研究表明，柠檬苦素在柑橘果实中的含量较少，但由于柑橘果实中含有大量的柠檬苦素前体物质——非苦味的柠檬苦素A环内酯（LARL）[5，8]，在食品加工过程中采用的酸性、冰冻等条件下，LARL在柠檬苦素D环内酯水解酶的催化下迅速转化为具有强烈苦味的柠檬苦素，从而导致柑橘汁产生后苦或延迟苦味的现象[4，9-12]。因此，降低加工后柑橘类果汁中的柠檬苦素含量是解决苦味现象的重要前提。

目前，脱除柠檬苦素等苦味物质的方法主要分为物理法和生物法，其中，物理脱苦法主要包括吸附脱苦、膜分离脱苦、超临界CO2脱苦、屏蔽法脱苦和添加苦味抑制剂脱苦等；生物脱苦法主要是通过酶或微生物来降解柑橘果汁苦味成分，从而达到脱苦的目的，主要包括酶法脱苦、固定化细胞脱苦和基因工程脱苦等[13-19]，酶法脱苦具有专一性强、效果好、风味和营养成分无破坏、成本低等优点，是目前主要的研究趋势[20]。文献报道中相关的脱苦酶主要有柠檬苦素D环内酯水解酶、柠檬苦素A-环内酯脱氢酶、柠檬苦素环氧酶、柠檬苦素醇脱氢酶等[21-24]，这些酶可以将柠檬苦素转化为柠檬苦醇、柠檬苦酸和17-脱氢柠檬苦素类A-环内酯[25-26]。但上述这些酶最适的作用条件均为碱性，在酸性环境中的活性降低，而在实际应用中常因果汁的低pH值而使酶失活，且生产成本高，不适合工业化需求。

为提供并丰富实际果汁加工过程中优质高效的脱苦酶来源，从生物脱苦的角度出发，前期试验从酸性的酿醋醋醅中筛选得到1株高效降解柠檬苦素的微生物菌株解鸟氨酸拉乌尔菌C6（Raoultella ornithinolytica），本研究对C6的降解特性及条件进行了研究，并对其分泌的柠檬苦素降解酶进行了分离纯化，以期为该菌及其酶系在柑橘汁的脱苦应用提供进一步的理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试菌株为柠檬苦素降解菌株解鸟氨酸拉乌尔菌 C6（Raoultella ornithinolytica），保存于山西大学生命科学学院微生物实验室。

1.2 试剂与仪器设备

1.2.1 试剂和培养基 柠檬苦素标准品（纯度≥98%）购自上海金穗生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

无机盐液体培养基：MgSO45 g，K2HPO410 g，KCl 5 g，KNO33 g，NaCl 2 g，柠檬苦素 6 mg，酵母膏1 g，蒸馏水 1 000 mL，以 HCl调 pH 值为 4.0（柠檬苦素质量浓度为6 mg/L）。

牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂 20 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 值自然（液体培养基中不加琼脂）。

酶反应溶液：MgSO45 g，K2HPO410 g，KCl 5 g，KNO33 g，NaCl 2 g，柠檬苦素 6 mg，溶解于 1 000 mL的pH值为4.0的柠檬酸缓冲液中。

染色液（1 L）：1.0 g考马斯亮蓝 G-250，250 mL异丙醇，100 mL冰醋酸，650 mL蒸馏水。

脱色液（1 L）：50 mL乙醇，100 mL冰醋酸，850 mL蒸馏水。

1.2.2 仪器设备 SW-CJ-2FD型洁净工作台，苏净集团安泰公司；HRHPY-300恒温培养摇床，青岛海尔特种电冰柜有限公司；HRSP-250H生化培养箱，青岛海尔特种电冰柜有限公司；BL-75型立式压力蒸汽灭菌筒，上海东亚压力容器制造有限公司；JA1203N电子天平，上海精密科学仪器有限公司；RE-52AA型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；SHZ-III型循环水真空泵，上海知信实验仪器技术有限公司；UV-2800型紫外可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；GZX-9023MBE型电热鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SB25-12DTDN型超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；离子交换层析柱（2.6 cm×20 cm）、凝胶过滤层析柱（1.6 cm×50 cm）、透析袋（截留分子量6～14 ku），上海华美生物公司；GIS-2009电泳凝胶成像系统，天能科技上海有限公司。

1.3 方法

1.3.1 解鸟氨酸拉乌尔菌C6对柠檬苦素降解特性

1.3.1.1 解鸟氨酸拉乌尔菌C6的生长曲线 挑取一环单菌落接入50 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃，150 r/min摇床培养12 h，制得种子液。将种子液以1%的接种量接入50 mL无机盐液体培养基中培养，每隔2 h取样一次，在600 nm处测定菌液的光密度值（OD600），绘制菌株生长曲线。

1.3.1.2 柠檬苦素降解曲线 将种子液以1%的接种量接入50 mL无机盐液体培养基中培养，每隔2 h取样一次，在600nm处测定菌液的光密度值（OD600），绘制菌株生长曲线，并测定培养基中柠檬苦素的含量，以不接菌的液体培养基为空白对照，计算解鸟氨酸拉乌尔菌C6对柠檬苦素的降解率，绘制降解曲线。

1.3.2 解鸟氨酸拉乌尔菌C6对柠檬苦素降解条件优化

1.3.2.1 单因素试验 将解鸟氨酸拉乌尔菌C6的种子液以1%的接种量分别接种到50 mL无机盐液体培养基中，37℃，150 r/min恒温振荡培养，考察种子液菌龄、底物柠檬苦素质量浓度、接种量和培养时间对柠檬苦素降解率的影响。

1.3.2.1.1 种子液菌龄对柠檬苦素降解率的影响柠檬苦素质量浓度6 mg/L，接种量1%，培养时间10 h，测定种子液菌龄为 6，8，10，12，14 h 时解鸟氨酸拉乌尔菌C6的柠檬苦素降解率。

1.3.2.1.2 柠檬苦素质量浓度对柠檬苦素降解率的影响 菌龄10 h，接种量1%，培养时间10 h，测定底物柠檬苦素质量浓度为 2，4，6，8，10 mg/L时解鸟氨酸拉乌尔菌C6的柠檬苦素降解率。

1.3.2.1.3 接种量对柠檬苦素降解率的影响 菌龄10h，底物柠檬苦素质量浓度6 mg/L，培养时间10 h，测定接种量为0.2%，0.6%，1.0%，1.4%，1.8%时解鸟氨酸拉乌尔菌C6的柠檬苦素降解率。

1.3.2.1.4 培养时间对柠檬苦素降解率的影响 固定菌龄10 h，接种量1%，底物柠檬苦素质量浓度6 mg/L，测定培养时间为 6，8，10，12，14 h 时解鸟氨酸拉乌尔菌C6的柠檬苦素降解率。

每组试验重复3次，取平均值。

1.3.2.2 响应面优化 根据单因素试验的结果，分别对每个因素选取低、中、高3个水平，利用试验设计软件Design-expert 8.06中的Box-Behnken设计方案，以解鸟氨酸拉乌尔菌C6对柠檬苦素降解率为响应值，采用4因素3水平的响应面分析法对降解条件进一步优化。响应面试验因素水平列于表1。

表1 Box-Behnken试验因素与水平

1.3.3 优化条件下解鸟氨酸拉乌尔菌C6的降解速率 在最优条件下，对不同培养时间下解鸟氨酸拉乌尔菌C6的柠檬苦素降解量进行测定，并计算柠檬苦素降解率。

1.3.4 柠檬苦素降解酶的分离纯化

1.3.4.1 柠檬苦素降解酶粗酶液的提取 前期试验表明，具有降解柠檬苦素活力的活性酶主要集中在发酵上清液中，属于胞外酶，粗酶液的提取参考文献[25]并略作改动：将菌株C6的种子液按1%的接种量接入装有50 mL发酵培养基的三角瓶（250 mL）中，37℃，150 r/min摇床培养12 h。培养物经3 500 r/min离心10 min除去菌体。取上清液加入硫酸铵至饱和度为80%，4℃静置过夜，10 000 r/min离心10 min分离沉淀蛋白，收集沉淀物，用pH值4.0的柠檬酸缓冲液冲洗2次后，溶解并定容至5mL，即为制得的柠檬苦素降解酶粗酶液，采用考马斯亮蓝法测定其蛋白含量。

1.3.4.2 硫酸铵饱和度的确定 取离心后菌株的发酵上清液，在冰浴环境下，边搅拌边缓慢加入饱和度不相同的固体硫酸铵（10%～90%，每10%为一间隔），4℃过夜沉淀后，10 000 r/min离心 15 min，将沉淀用少量蒸馏水溶解，放置于透析袋中进行透析除盐。分别测定各不同饱和度下的柠檬苦素降解酶活力和蛋白量，并绘制出硫酸铵沉淀曲线以确定硫酸铵沉淀的最适饱和度。

将发酵上清液以最适的硫酸铵饱和度沉淀后盐析，4℃静置过夜，10 000 r/min离心30 min，剔除上清液，将沉淀用少量蒸馏水溶解，放置于透析袋中充分透析除盐24 h（中间每隔4 h换一次透析液），聚乙二醇浓缩后即可得到经过初步纯化的粗酶液，4℃保存备用。

1.3.4.3 Sephadex G-100凝胶过滤层析 Sephadex G-100凝胶柱（1.6 cm×50 cm）装柱后，首先用0.02 mol/L，pH值为4.0的柠檬酸缓冲液平衡，然后把经过硫酸铵沉淀、透析脱盐、浓缩后的粗酶液5 mL加到已平衡过的凝胶柱中，并用0.02 mol/L，pH值为4.0的柠檬酸缓冲液洗脱，流速为1 mL/min，用自动部分收集器每5 mL收集一管，采用紫外检测仪于280 nm波长处进行检测，跟踪监测蛋白质含量；根据洗脱曲线，收集每个洗脱峰，测定降解柠檬苦素的活性，确定具有降解柠檬苦素酶活性的目标峰并收集，合并后于4℃透析，用聚乙二醇浓缩至5 mL，4℃保存备用。

1.3.4.4 DEAE-纤维素离子交换层析 DEAE-纤维素离子交换柱（2.6 cm×20 cm）装好后，预先用0.02 mol/L，pH值为4.0的柠檬酸缓冲液平衡，然后将经Sephadex G-100凝胶柱收集的活性峰浓缩后的样品上样（上样量为1 mL），先用缓冲液洗脱至样品完全吸附（洗涤未结合的杂蛋白至记录仪显示无蛋白随平衡缓冲液流出），再用0～1 mol/L的NaCl溶液（缓冲液配制）进行线性梯度洗脱，流速为2 mL/min。利用自动部分收集器每5 mL收集一管，于280 nm波长处采用紫外检测仪进行检测，跟踪监测蛋白含量；根据洗脱曲线分别收集每个洗脱峰，测定并收集具有降解柠檬苦素活性的目标峰，合并后于4℃透析，浓缩，4℃保存备用。

1.3.4.5 降解柠檬苦素酶纯度鉴定及分子质量测定

采用SDS-PAGE垂直板电泳法[27]鉴定通过多步分离纯化后的蛋白酶的纯度并测定其相对分子质量。SDS-PAGE垂直板电泳采用分离胶质量分数为12%、电流强度为15 mA，浓缩胶质量分数为5%、电流强度为10 mA。电泳于3 h后停止，采用考马斯亮蓝G-250染色，脱色后拍照。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 柠檬苦素的含量测定 以高氯酸∶冰醋酸体积比为4∶5制得酸母液，取酸母液30 mL，加入1.11 g对二甲胺基苯甲醛，制得DMAB指示剂，现配现用。

准确吸取质量浓度为0.2 mg/mL的柠檬苦素标准溶液0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0mL于试管中，分别加甲醇（色谱纯）至2.0 mL，再快速加入3 mL DMAB指示剂和3 mL酸母液，室温放置30 min后，于470 nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、柠檬苦素标准液的质量浓度（μg/mL）为横坐标，绘制柠檬苦素标准曲线。并求得回归方程为y＝0.009 4x＋0.032 5（R2＝0.998 7），柠檬苦素质量浓度在0～0.20 g/L范围内线性关系良好。

将培养后的反应体系经丙酮超声提取后旋蒸至干，用10 mL甲醇定容。从中吸取2 mL样液，快速加入3 mLDMAB指示剂和3 mL酸母液，室温放置30 min后，以未接入菌种的无机盐液体培养基作参比，在470 nm处测吸光度，依标准曲线求柠檬苦素的含量[25]；并按公式（1）计算柠檬苦素降解率。

式中，m1为对照中的柠檬苦素含量；m2为降解后样品中残余柠檬苦素含量。

1.4.2 柠檬苦素降解酶酶活力测定[25-26]取4支10 mL的EP管，设定1支对照管及3支测定管。每管加入1 mL酶反应溶液，然后各测定管加入1 mL待测酶液，对照管中加1 mL蒸馏水，反应10 min。将测定管和对照管分别沸水浴15 min以终止酶反应。冷却后，用甲醇定容至10 mL，从中吸取2 mL样液，分别快速加入3 mL DMAB指示剂和3 mL酸母液，室温放置30 min后，在470 nm处测定吸光度，并根据柠檬苦素标准曲线求出4支EP管中柠檬苦素含量。每毫升酶液在酶反应条件下每分钟所降解的柠檬苦素的微克数为一个酶活力单位。酶比活力是指在不同的影响因素下，各水平酶活力与最高酶活力的比值[28]。

式中，N为稀释倍数。

1.5 数据处理

采用SPSS 22.0对数据进行分析，并用Origin Pro软件作图。

2 结果与分析

2.1 降解特性研究

图1表示柠檬苦素降解菌C6在以柠檬苦素为唯一底物的培养基中生长和降解柠檬苦素的情况。由图1可知，0～2 h为该菌株的生长延滞期，从2 h开始进入对数生长期，12 h之后进入稳定期。随着菌株的生长，菌株对底物柠檬苦素的降解率也逐渐增加，在2～12 h内柠檬苦素降解能力明显增加，后期趋于稳定，且菌株的柠檬苦素降解曲线与其生长曲线的增长趋势保持一致，推测该菌株的柠檬苦素降解能力可能与其生长量有关，即随着生长量的增加其降解柠檬苦素的能力也逐渐增加，降解菌C6发挥作用的酶系可能为组成酶。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 种子液菌龄对柠檬苦素降解率的影响 从图2可以看出，种子液菌龄对菌株C6的柠檬苦素降解能力有较大的影响，随着菌龄的增加，菌株的柠檬苦素降解率也逐渐增加，当菌龄为8 h时，培养后菌株的柠檬苦素降解率达70%以上；当菌龄为10 h时，降解效果最佳，降解率为74.25%；此后降解率随菌龄的延长而降低。因此，选择的最佳菌龄为10 h，以达到最佳的效果，加快生物降解速率。

2.2.2 接种量对柠檬苦素降解率的影响 接种量的大小决定发酵过程中微生物的增长速度，适宜的接种量可以缩短发酵周期[29]。接种量对菌株C6降解柠檬苦素的影响如图3所示，随着接种量的增加，C6的柠檬苦素降解率呈现先升高后降低的趋势，当接种量为1%时，相应菌株的柠檬苦素降解率最高，达到83.47%，说明在该接种量下,菌株对柠檬苦素的利用效率最高；当接种量超过1%时，柠檬苦素降解率逐渐降低。故选择的最佳接种量为1%。

2.2.3 底物柠檬苦素质量浓度对柠檬苦素降解率的影响 柠檬苦素质量浓度对菌株降解柠檬苦素的影响如图4所示，随着底物柠檬苦素质量浓度的增加，柠檬苦素降解率先升高后降低，在柠檬苦素质量浓度为0～4 mg/L时，柠檬苦素降解率呈现升高趋势；在底物柠檬苦素添加量为4 mg/L时体系中菌株的降解率达到最大（85.26%）；当底物柠檬苦素质量浓度超过4 mg/L时，菌体的降解能力反而减弱，可能是由于高质量浓度的底物对菌体的生长和作用起到一定的抑制作用。故选择的最佳柠檬苦素质量浓度为4 mg/L。

2.2.4 菌种培养时间对柠檬苦素降解率的影响微生物的发酵都有其特定的发酵周期，发酵时间短不利于菌株中相应作用酶的合成，发酵时间过长菌体会发生自溶，同样不利于发酵[30]。图5结果表明，菌株在培养6 h后柠檬苦素降解率逐渐增加，并达到最佳培养时间段，即在培养12 h时，降解率达到80.61%；之后随着培养时间的延长，培养基中营养物质不断消耗，有毒代谢产物积累，菌体可能发生自溶或产物的反馈抑制作用，致使降解率逐渐降低。因此，选择12 h作为最佳培养时间。

2.3 响应面试验结果

2.3.1 柠檬苦素降解率的二次多项回归方程 如表2所示，将菌龄、柠檬苦素质量浓度、接种量、培养时间作为研究条件，以柠檬苦素降解率为响应值，共得到29个试验点，其中27个为析因点，1个为中心点，中心点试验进行了5次，用来估计误差。

通过Design-Expert 8.06软件对表2的数据进行多元回归拟合，获得对柠檬苦素降解率（Y）的二次多项回归方程为Y＝91.69＋0.18A＋0.64B－0.58C－0.079D－1.11AB－1.32AC－7.5×10-3AD＋1.15BC－0.32BD－0.30CD－2.91A2－1.69B2－2.41C2－1.55D2，对该回归模型及系数进行显著性检验，其结果列于表3。

2.3.2 回归模型的方差分析 对回归数学模型进行方差分析，以检验方程的有效性和各因子的偏回归系数，回归模型的方差分析如表3所示。通过统计学分析可以发现，该试验选用的模型极显著（P＜0.000 1），方差的失拟项不显著（P＝0.826 4＞0.05），说明模型的选择是合适的。另外，模型调整确定系数R2Adj为0.806 9，说明模型能解释80.69%响应值的变化，拟合程度较好。因变量与所考察自变量之间的复相关系数R2为0.903 4，说明该模型拟合程度较好，试验误差小，可用该回归方程代替真实点对试验结果进行分析。由表3还可知，各因素对柠檬苦素降解率影响程度的大小顺序为：柠檬苦素质量浓度＞接种量＞菌龄＞培养时间。同时，表3结果还显示，在此试验设计中，B，C，AB，AC，BC项显著（P＜0.05），A2，B2，C2，D2项均为极显著（P＜0.01）。

表2 响应面试验设计与结果

表3 方差分析

2.3.3 最佳降解条件的确定 根据回归模型，得出柠檬苦素降解率取最高值的各因素的优化组合为菌龄10.05 h，底物柠檬苦素质量浓度4.29 mg/L，接种量0.96%，培养时间12.04 h，在此条件下，柠檬苦素降解率的理论最高值为91.77%。考虑到实际操作的可行性，将培养条件调整为菌龄10 h，柠檬苦素质量浓度为4 mg/L，接种量1%，培养时间为12 h，在此优化条件下进行3次平行验证试验，结果表明，菌株C6的柠檬苦素降解率为91.28%±0.17%，与理论值（91.77%）接近，说明该试验模型可以较好地预测优化柠檬苦素降解菌的培养条件，具有实际应用价值。

2.4 最优条件下菌株C6的柠檬苦素降解速率分析

试验进一步考察了菌株C6在优化培养条件下12 h内降解柠檬苦素的速率（图6）。由图6可知，最优条件下，将菌龄10 h的菌株以1%的接种量加入到底物柠檬苦素质量浓度为4 mg/L的培养基中，以培养基中柠檬苦素含量的减少量来表征菌株对柠檬苦素的降解速率，相比在培养时间为0～9 h培养基中柠檬苦素含量缓慢降低；培养9～11 h时柠檬苦素含量急剧下降。可见，菌株C6培养9 h后对柠檬苦素的降解能力迅速增加，降解速率也随着快速增加；11～12 h时降解速率趋于平缓。

2.5 柠檬苦素降解酶的分离纯化

2.5.1 硫酸铵饱和度的确定 在发酵上清液中以不同的硫酸铵饱和度（10%～90%）沉淀粗酶液，测定其透析液的蛋白析出量，作硫酸铵饱和度—蛋白析出量曲线（图7）。由图7可知，在40%～80%饱和度范围内，蛋白析出质量浓度随硫酸铵的饱和度的增加而增加；当硫酸铵的饱和度大于80%时，蛋白析出量并没有显著增加。因此，选择饱和度为80%的硫酸铵进行沉淀。

向上清液中加入饱和度为80%的硫酸铵，4℃静置过夜，收集沉淀，透析，测定透析液的总酶活力为13 194 U，总蛋白质量为 217.64 μg（表 4）。

表4 柠檬苦素降解酶纯化结果

2.5.2 Sephadex G-100凝胶过滤柱层析 将通过硫酸铵沉淀、透析脱盐、浓缩后的蛋白样品上SephadexG-100凝胶过滤柱，得到如图8所示的洗脱曲线。

从图8可以看出，上清液经凝胶过滤柱后出现2个明显的洗脱峰，合并同一峰的洗脱液，浓缩后测定各个峰的蛋白含量和柠檬苦素降解活性，结果显示，峰1中蛋白含量为0.02 g/L，降解柠檬苦素酶活力为19.47 U；峰2中蛋白含量为0.013 3 g/L，活性为172.94 U。可见，具有降解柠檬苦素能力的活性蛋白主要集中在峰2。

2.5.3 DEAE-纤维素柱层析 峰2浓缩后经DEAE-纤维素柱层析分离，对应的洗脱曲线如图9所示，收集3个洗脱峰，合并后测定相应的蛋白含量和柠檬苦素降解活性，结果表明，蛋白质主要集中在9～42管，且在第16，37管出现2个活性峰，其中，第16管蛋白质含量最高，达到0.925 μg/mL；具有柠檬苦素降解活性的酶主要集中在第7～26管，经透析、浓缩后测定柠檬苦素降解酶活力为354.51 U，而35～42管为杂蛋白，不具有柠檬苦素降解活性。

2.5.4 酶纯化结果 发酵上清液经硫酸铵盐析、Sephadex G-100层析、DEAE-纤维素柱层析后，每一个纯化步骤后所得到的酶比活力、纯化倍数以及酶活力回收率如表所4所示。

由表4可知，粗酶液在经过3步分离纯化操作后，酶的纯化倍数为9.44倍，酶活力回收率35.13%，比活力为354.52 U/μg，纯化效果明显。

2.5.5 酶纯度鉴定及分子量的测定 对纯化后的柠檬苦素降解酶进行SDS-PAGE电泳试验，结果如图10所示，纯化后的柠檬苦素降解酶在SDS-PAGE电泳上为单一条带，达到了电泳纯，其相对分子质量为27 ku左右。

3 结论与讨论

本试验对前期从醋醅中筛选出的菌株C6的降解特性进行了研究，明确了其生长量与降解柠檬苦素之间的关系，对柠檬苦素降解菌的生长周期测定可知，12 h之后进入稳定期，生长曲线趋于平衡，其降解曲线与生长曲线总体趋势保持一致。探讨了菌龄、底物柠檬苦素质量浓度、接种量、培养时间等单因素对菌株降解柠檬苦素的影响，并在单因素基础上，应用Box-Benhnken中心组合试验和响应面分析法，确定了柠檬苦素降解菌的最优发酵条件：菌龄10 h、柠檬苦素质量浓度4 mg/L、接种量1%、培养时间12 h，在此条件下，柠檬苦素降解率达到91.28%±0.17%，9 h以后降解速率迅速增加。采用硫酸铵沉淀、透析、浓缩、Sephadex G-100凝胶过滤层析、DEAE-纤维素柱层析对该菌株产生的柠檬苦素降解酶进行逐步纯化，得到电泳纯的柠檬苦素降解酶（相对分子质量为27 ku），纯化倍数为9.44，比活力提高到354.52 U/μg，回收率为35.13%。

试验填补了酸性环境中生物脱苦的应用空白，对柠檬苦素降解菌和相关酶系的特性进行了初步研究，经纯化得到的柠檬苦素降解酶，其酶活力明显高于目前文献报道的D环内酯水解酶、柠酸A-环内酯脱氢酶、柠檬苦素环氧酶、柠檬苦素醇脱氢酶等的降解活性[21-24，31-35]，并且在酸性环境中具有显著的降解优势，后期将对菌株C6柠檬苦素降解酶的作用机制和降解途径进一步研究，并通过柑橘汁中的脱苦评价，以期提高该酶在实际生产上的适用性。