非洲猪瘟疫苗研究进展

2019-03-13康桦华冯锈华袁子国王晓虎

传染病信息 2019年1期

何洋，康桦华，冯锈华，向华，陈晶，黄忠，袁子国，王晓虎

非洲猪瘟（African swine fever,ASF），是以非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）为病原所引起的急性、热性、高传染性、超高致死性的疾病，一旦发病，无药可治，病死率可达100%，属于国际动物卫生组织A类疫病，也是我国一类疫病之一[1]。ASFV是一种巨大的20面体结构的DNA病毒，其基因组为线性双链DNA分子，不同分离株的大小存在差异，长度在170～193 nm之间。由于ASFV介于痘病毒与虹膜病毒之间的特征，研究者将其划分为非洲猪瘟病毒属，且是惟一成员[2]。ASFV主要依赖巨噬细胞及网格蛋白介导的内吞作用进入宿主细胞，以宿主巨噬细胞为靶细胞[3-4]。根据其毒力差异，可分为高致病性、中等毒力、低毒力及感染无临床症状的毒株。

ASF首次报道于1921年。1909 1915年东非暴发了一种由病毒所引起的针对家猪的致命性疾病，当时认为这是一种由猪瘟病毒变异所导致的疾病，因该病多发生于复杂的非洲野生环境中，故研究者将野生动物，特别是疣猪视为主要的传染源[5]。后来研究发现，ASF是由在疣猪巢穴内生长的一种携带ASFV的软蜱持续传播所致，ASFV是一种以虫媒介为主要传播方式的病毒[6]。在20世纪上半叶，ASF仅肆虐于东非以及南非部分国家，对该地区的家猪养殖业造成了极大的冲击[7]。1957年，ASF以安哥拉为跳板，首次进入了欧洲国家，虽然很快在葡萄牙的里斯本地区被扑灭，但未能将其彻底根除，在之后很长一段时间内流行于撒丁岛。直至1995年，随着西班牙疫情的扑灭[8]，欧洲范围内的ASF疫情才得以控制。然而，野猪作为ASFV的携带者，其生活习性为病毒的传播与流行提供了极大助力，使得ASF在2007年再度流行，并进一步向东欧、美洲和亚洲蔓延[9]。2018年8月我国暴发了第一起ASF疫情，并逐步在我国境内蔓延。目前针对ASF，尚未研制出能提供全面保护的疫苗。本文主要针对ASF的疫苗研制实验进行综述，以期为ASF的防治提供思路与方向。

1 灭活疫苗

灭活疫苗，是通过物理或化学手段，使病原微生物丧失感染性与毒性，又保留免疫原性的一类疫苗。ASF疫苗的生产最初也尝试利用这种经典的疫苗制备手段，但遗憾的是，利用感染ASFV的猪肺泡巨噬细胞或者感染脾脏匀浆所制备的灭活疫苗既无法检测到血清学反应，也未能产生针对同源病毒的保护性免疫。而接种经纯化或超声处理的感染细胞所制备的灭活疫苗后，虽然确实能够诱导接种动物产生抗体，且可以从血清中检测到，但是依然无法保护接种动物免受病毒侵害[10-11]。

如果说灭活疫苗自身免疫原性的缺陷是导致机体出现较弱甚至不产生免疫应答现象的原因，那么与免疫佐剂联用的效果又如何呢？Blome等[12]利用最先进的免疫佐剂Polygen TM与Emulsigen重新分别与灭活ASF疫苗联用，评估结果仍然与之前类似，即虽然可以诱导实验动物产生相应的抗体，但是却不能与ASFV发生中和反应，自然也无法使接种动物获得免疫性保护，同时在实验的过程中发现过高的抗体水平反而可能会影响疫苗的功效。目前看来，由于抗体在ASF中的免疫保护作用尚不清楚，故灭活疫苗的使用还须更进一步地探讨与研究。

2 弱毒疫苗

弱毒疫苗是一种经典的传统疫苗，它是通过自然筛选或人工致弱等手段处理后培养制备的弱毒株。由于弱毒活疫苗利用方便，成本低廉，免疫原性好，免疫期长的特点，一直属于主流的流行病防控手段[13]。研究者针对ASFV的弱毒疫苗研制主要可分为两大类，即天然弱毒疫苗与人工弱毒疫苗。

2.1 天然弱毒疫苗 ASFV/NH/P68与OUR/T88/3是ASFV的两类天然弱毒株。其中ASFV/NH/P68能够促进细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte,CTL）与NK细胞的活性，并且经ASFV/NH/P68免疫后的家猪可以抵御ASFV/L60强毒株的攻击[14-15]，但是会引起部分免疫猪出现慢性感染的现象。

经OUR/T88/3免疫的家猪，能够抵御OUR/T88/1毒株的攻击，但是随着CD8+T淋巴细胞的消耗，也会使免疫效果减退，造成对OUR/T88/1毒株的不完全保护[16]，提示CD8+T淋巴细胞在ASFV的保护性免疫中占重要角色。受OUR/T88/3免疫的家猪，同样能够对Benin 97/1分离株与genotype X Uganda分离株产生免疫[17]，表明利用OUR/T88/3毒株制备具有交叉保护作用的疫苗具有可行性。在不同区域以不同剂量的OUR/T88/3免疫动物，可产生不一样的免疫效果，它们的差距甚至达到了1.5～2.0倍，提示免疫方式与剂量也会对免疫效果造成影响[18]。与一般的天然弱毒疫苗免疫接种动物后造成或轻或重的不良反应一样，受OUR/T88/3免疫的动物会出现发热、关节肿胀等临床症状[16-18]。天然弱毒疫苗存在的生物安全风险限制了其作为防控疫苗的实际使用价值与可行性。

2.2 人工弱毒疫苗人工弱毒疫苗又可以分为传代致弱毒活疫苗与重组致弱毒活疫苗。ASFV可在猪源细胞系如Vero与CV1内不断传代，降低其毒力。然而由于病毒外膜脂质的差异，之前可产生中和反应的血清对以传代方式降低毒力的毒株不再具备好的中和活性[19]。历史上，在西班牙与葡萄牙两国，都曾有过利用传代致弱毒株免疫动物却产生灾难性后果的记录，所免疫动物呈现出急性与慢性的ASF症状，大量死亡，而存活下的动物也多数携带ASFV，成为之后ASF疫情的传染源，这种情况导致了传代致弱毒活疫苗开发与应用的延滞[20]。

虽然目前关于传代致弱毒活苗的开发并不乐观，但是依然有不少的研究小组在进行尝试。Krug等[21]将ASFV-G（佐治亚共和国株）在Vero细胞中连续传代后发现，随着传代次数增多，毒株毒力不断下降，在第110代完全丧失毒力，并且不能赋予免疫动物对ASFV-G的免疫。同时其在原代猪巨噬细胞内的增殖能力下降，而在Vero细胞内的增殖能力随传代次数增多而增强。Lacasta等[22]则发现，将用强毒E75在CV1细胞系上传代致弱的E75CV1毒株进行免疫后发现，弱毒株产生了与亲本截然不同的免疫途径，并且E75CV1能免疫同源E751的攻击，但不能对异源毒株BA71产生保护性免疫。目前来看，传代致弱毒活疫苗虽然仍存在生物安全问题，但同样有机会成为抗ASFV的候选疫苗之一。

重组致弱毒活疫苗则是利用分子生物学技术对病毒的基因、结构进行改变来实现病毒毒力的减弱，以此开发的对机体低毒性而又能长期免疫的疫苗。ASFV入侵机体总伴随着各种逃避宿主免疫反应的分子机制，比如通过A238L蛋白来抑制T细胞中NF-κB和核激活因子，或者由EP402R和EP153R基因编码的CD2v凝集素样蛋白调节宿主的防御，亦或通过多基因家族蛋白（MGF505-2R）改变干扰素的产生[23]。

科学家们则以此为方向，利用分子生物学手段，尝试制备重组致弱毒活疫苗。Borca等[24]构建了CD2样蛋白8-DR缺陷性ASFV毒株，并检测其功能变化，研究发现虽然未降低毒株毒力，但是能抑制宿主的免疫活性，提示8-DR参与了病毒早期的感染过程。Abrams等[25]则将OUR/T88/3中的DP71L与DP96R基因敲除，使其毒力降低，并构建了缺陷性毒株OUR/T88/3DeltaDP2。免疫后发现相较于亲本OUR/T88/3的免疫效果来说，缺陷性毒株产生的免疫保护效果仅为66%。这提示毒株毒力的强弱可能会影响其免疫保护的效果。Vivian等[26]则利用ASFV-G毒株构建了B119L基因缺陷性ASFV-G-Δ9GL，发现低剂量的缺陷性毒株不仅不会诱发毒性反应，甚至在感染第21 d与28 d分别赋予了机体部分及完全性的免疫保护。Reis等[27]以Benin 97/1为模板分别构建了MGF530及MGF360缺陷性毒株BeninΔMGF，研究发现所有免疫猪除了有发热症状外无其他临床症状，并且都能抵御Benin 97/1的攻击，而在接种缺陷性毒株后，以OUR/T88/3株加强免疫，仍有75%的免疫保护效果。

IFN调节的缺失，也是构建减毒ASFV毒株的思路之一。O'Donnell等[28]在之前的实验基础上，敲除了基因UK（DP96R），发现可以实现高剂量下的无毒性诱导，仅仅两周就能够实现对ASFV-G 2007分离株的免疫。可以说是目前为止最为成功的实验性弱毒活疫苗。以此看来，部分重组致弱毒活疫苗已经实现了一定程度的生物安全保证，但是敲除的基因是否会对病毒造成其他影响而导致免疫失效仍须要继续验证。

3 核酸疫苗

核酸疫苗是一种利用病原体的抗原基因与真核表达载体重组构成的质粒，当其转入动物体内时，能表达病原体的有效抗原成分，引起保护性免疫[29]。有尝试利用核酸疫苗抗ASFV感染的研究，但是却因核酸疫苗在大型动物体内免疫原性不乐观的情况而备受争议。随着对ASFV的深入研究，发现CD8+T细胞效应是ASFV免疫过程中的关键[30]。为了加强核酸疫苗的免疫原性，Argilaguet等[31]通过将ASFV基因P54与P30串联为PQ后与猪白细胞抗原II的抗体可变片段框APCH1融合，构建成新的质粒pCMVAPCH1PQ，虽然可以令猪对抗原的免疫应答能力成倍增强，但无法针对致死性ASFV提供免疫性保护，也无法产生中和反应。Argilaguet等[32]将ASFV基因P54与P30，ASFV血凝素（sHA）的决定簇及泛素融合，构建了新的质粒载体pCMVUbsHAPQ，旨在增强诱导CTL的效应。该质粒成功诱导了猪的体液与细胞免疫，并且使部分免疫猪在致死性ASFV-E75的攻击下得到保护。这提示细胞免疫与预防ASF密切相关。该课题组还发现，通过表达文库可使约60%的免疫猪免于ASFV-E75的攻击，提示单一的基因表达免疫仅能提供有限的保护能力，而ASFV基因组中还存在着其他影响免疫应答的因素[33]，仍须要更进一步地深入研究。

4 亚单位疫苗

亚单位疫苗多是利用病原体不含核酸的表面抗原，诱发机体产生抗体的一种疫苗。科研人员利用昆虫杆状病毒表达系统，表达了ASFV的P12蛋白，实验发现重组表达P12蛋白能够以剂量依赖的形式抑制多种ASFV分离株在体外猪肺泡细胞上的增殖复制，但是却无法提供免疫性保护[34]，这提示P12作为ASFV的附着蛋白影响了病毒的早期感染。ASFV的P72蛋白、P54蛋白及P30蛋白的抗体，能够在病毒攻击易感细胞后中和病毒，抑制病毒的依附、复制及内化的过程[34]。虽然分别利用杆状病毒表达系统表达P30蛋白、P54蛋白、P72蛋白及P22蛋白都可以有效诱导机体产生中和抗体，但是并不能提供有效的免疫保护，而当联用P30蛋白与P54蛋白共同免疫时，却产生了不同程度甚至完全性的免疫保护[35-37]。这表明单一抗原引起的免疫应答不足以提供全面的保护，由抗体介导的保护作用之间也存在互补的关系。近年来，通过将载体表达ASFV抗原引发免疫原性作为首免，然后利用减毒活疫苗加强免疫的策略，扩宽ASFV表位的识别，这也是一种亚单位疫苗与传统疫苗联用的防治思路[38]，因此，鉴定更多的ASFV保护性抗原，开发新型的免疫佐剂，都是提高ASFV基因工程亚单位疫苗免疫效力的可行思路。

5 病毒活载体疫苗

许多研究表明，细胞免疫在抗ASFV中扮演重要角色，而CTL的效应更是免疫效果的保证[31-33]。因此，有学者利用病毒活载体可在机体内持续复制与表达的特性，研制以腺病毒、甲病毒为载体重组ASFV部分抗原基因的病毒载体疫苗。Lokhandwala等[39]构建了混合ASFV-P32、P54、P62和P72抗原的腺病毒载体疫苗，获得了较好的抗原特异性CTL应答。而Murgia等[38]则利用甲病毒载体，分别构建表达ASFV p30（RP-30）、p54（RP-54）、pHA72（RP-sHA-p72）的抗原载体，并且在Vero细胞中获得的重组病毒RP-30具有较好的免疫原性。目前关于病毒活载体疫苗的安全性仍须要通过攻毒保护实验来进一步验证。

6 展望

随着科学技术的不断发展与进步，针对ASF的防治疫苗，也从开始的灭活疫苗尝试，向针对病毒感染宿主的特定机制入手。虽然在ASFV功能结构、入侵方式及宿主对ASFV的免疫应答方面取得不少成果，并以此尝试了多类别的疫苗开发而获得了一定效果，但是，仍然无法改变尚无有效疫苗可用的现状。目前看来，弱毒活疫苗由于能在保留病毒较完整结构的前提下，最大限度的降低毒力，并且可在机体内复制，持续诱导中和抗体产生，成为可提供高效、安全的保护性疫苗的首选。但是，它的缺点也同样无法忽视，如复杂环境下可能出现的毒力返强现象，对易感动物的攻击性等都是必须要面对的生物安全问题。

我们对目前ASF灭活疫苗、弱毒活疫苗、核酸疫苗、亚单位疫苗以及病毒活载体疫苗的研究进展及其优缺点进行简要汇总（表1）。此外，除了利用疫苗作为对抗ASFV手段，也有直接针对病毒转录复制过程来抑制病毒增殖的手段，例如利用RNA干扰技术，敲降ASFV的A151R和VP72基因，抑制病毒的体外复制能力[40]，或者利用有机试剂氟喹诺酮，金雀异黄酮直接阻断ASFV DNA的复制，干扰其复制周期，达到抑制病毒增殖的目的[41-42]。这些都为ASF的防治提供了新的手段。从长远来看，高效安全的特异性疫苗仍旧是防治ASF的最佳手段，因而更高效的免疫佐剂探索，更可靠的生物安全风险控制，更宽广的抗原位点识别研究以及多种疫苗的相互联用，都是今后值得关注的研究方向。