北京市腹泻儿童人博卡病毒VP1区基因特征分析

吉彦莉，王永全，崔海洋，靳 博

感染性腹泻是全球儿童常见传染病，是5岁以下儿童死亡的第二大原因。在我国，感染性腹泻的发病率一直位居肠道传染病的首位，疾病负担严重[1-3]，已纳入《中华人民共和国传染病防治法》管理。研究表明，病毒是引起婴幼儿感染性腹泻的最主要原因，其中，诺如病毒、轮状病毒、肠道腺病毒和星状病毒是4种最常见的致泻病毒[4-5]，同时也是病毒性腹泻常规监测项目。但是，仍有近50%的儿童急性腹泻病原不明确[6-8]。

人博卡病毒（human bocavirus,HBoV）是瑞典学者Allander于2005年发现的一种细小病毒[9]，是单正链无包膜DNA病毒，基因组全长约5.6 kb，目前共发现4种型别（HBoV1～4型）。因HBoV在急性腹泻粪便中频繁检出[10-12]，引起了国内外学者的关注，多项病例对照研究都证明了其与腹泻的相关性[13-14]。作为一种新发腹泻相关病毒，

HBoV尚未被纳入常规腹泻病原学监测，相关研究在我国亦不多见。本研究通过对北京地区急性腹泻儿童HBoV的感染状况及基因进化特征的研究，为儿童病毒性腹泻的防控提供依据。

1 资料与方法

1.1 资料来源 2015年11月 2016年12月，采集哨点医院（北京大学第一医院、北京市儿童医院）门诊就诊的急性腹泻儿童粪便标本。患儿年龄＜5岁，发病时间＜3 d，就诊主诉为呕吐或腹泻等消化道症状。

1.2 标本前处理 将粪便标本与PBS充分震荡混匀，制成10%的粪便悬液，8000 rpm离心5 min，取上清液备用。

1.3 HBoV检测 用QIAamp® MinElute Virus Spin Kit（Qiagen）提取病毒核酸，通过巢式PCR扩增HBoV VP1区部分序列，引物序列见表1，反应条件参照文献[13]。目的片段条带为567 bp，用QIAxcel Advanced毛细管电泳进行检测。PCR阳性产物送北京诺赛基因组研究中心有限公司进行纯化回收及序列测定。

1.4 HBoV进化分析 将测序结果通过 BLAST比对确定病毒型别。下载Genbank中不同型别和亚型、不同地域及不同时间分布的HBoV序列，作为参考序列。用 Vector NTI AlignX计算毒株间序列相似性。用MEGA7进行序列和进化分析，用邻接法构建进化树，用Kimura双参数模型计算遗传距离。

表1 HBoV巢式PCR引物Table 1 Nested PCR primers for HBoV

2 结 果

2.1 腹泻儿童基本情况 2015年11月 2016年12月，共收集到396例5岁以下腹泻儿童粪便标本。患儿中，男223例，女173例，男女比例为1.29∶1。患儿最大月龄58个月，最小为0个月，月龄中位数为12个月。

2.2 HBoV的检出情况 共检出HBoV 30例，总检出率为7.58%。其中，HBoV1型检出17例，检出率为4.29%；HBoV2型检出11例，检出率为2.78%；HBoV3型检出2例，检出率为0.51%，未检出HBoV4型。

2.3 HBoV序列分析 将30例HBoV北京株（基因型别为：HBoV1、HBoV2及HBoV3）VP1区序列与Genbank中的序列进行BLAST比对。序列分析显示30例HBoV北京株在VP1区核苷酸序列相似性为71%～100%，氨基酸序列相似性为85%～100%。其中，17例HBoV1北京株序列相似性为96%～100%，与HBoV1参考序列相似性为98%～99%；11例HBoV2北京株序列之间相似性为96%～100%，与HBoV2参考序列相似性为91%～99%；2例HBoV3北京株序列相似性为99%，与HBoV3参考序列相似性为97%～98%。

2.4 HBoV分子进化分析 系统进化树显示，HBoV包括4个进化树分支，分别为HBoV1、HBoV2、HBoV3和HBoV4。本研究中的所有序列均位于HBoV1～3型分支上（图1）。其中，HBoV1型北京株分支包括两簇：BJ16-325自成一簇，与其他HBoV1型序列差异达4%；其余HBoV1型序列高度同源（相似性为98%～99%），共同构成一簇。HBoV1 VP1区氨基酸序列比对分析也表明，BJ16-325与其他HBoV1型北京株相比，氨基酸特异变化位点最多，为4个（图2），表明BJ16-325出现了较高程度的变异。

既往国内外报道将HBoV2分型为HBoV2A和HBoV2B 2个亚型。而本研究显示，HBoV2型序列在进化树上包括3个亚型分支（bootstrap＞90），本研究中所有HBoV2型北京株序列均独立于HBoV2A和HBoV2B亚型，位于一个新的亚型分支上。同源性分析表明，本研究中的HBoV2型北京株与HBoV2A、HBoV2B亚型间相似性分别为91%～93%及92%～93%，低于HBoV2A和HBoV2B亚型间的相似性（95%～96%）。此外，通过kimura-2-parameter模型计算遗传距离发现，该HBoV2北京株序列与HBoV2A、HBoV2B亚型参考序列间平均遗传距离分别为0.079和0.081，均高于2A与2B亚型之间的平均遗传距离（0.045），由此表明该HBoV2型北京株序列为HBoV2的一个新的亚型。

图1 北京地区HBoV生物进化树Figure 1 Phylogenetic tree of HBoV in Beijing

3 讨 论

婴幼儿是急性感染性腹泻的高发人群，发病率和病死率高，是值得关注的公共卫生问题。2005年Allander首次发现了HBoV，之后不断有学者从腹泻粪便中检出HBoV。本研究显示，北京地区5岁以下急性腹泻儿童HBoV检出率为7.58%，与重庆、上海等地结果相似[15-16]。因时间、地域、人群免疫力及检测方法等不同，HBoV检出率可出现较大差别[17-18]。

图2 HBoV1北京株VP1区部分氨基酸序列比对Figure 2 Amino acid sequence alignment of partial VP1 region of HBoV1 Beijing strains

HBoV包括HBoV1～4 4种基因型，其中HBoV3型和HBoV4型检出率低，较为少见。本研究中检出的HBoV北京株包括HBoV1、HBoV2和HBoV3 3种型别。从进化树上可以看到，北京地区的1株HBoV1序列BJ16-325在进化树上自成一簇，且与HBoV1其他序列变异程度相对较大，差异达4%。而Zhao等[19]对当地连续8年腹泻病例HBoV的进化研究表明：HBoV1在VP1区高度保守，8年间所有HBoV1毒株在VP1区的变异仅为1%。这表明北京地区至少存在2组不同来源HBoV1毒株的流行。此外，值得注意的是，以往国内外报道将HBoV2分为HBoV2A和HBoV2B 2个亚型。而本研究中检出的所有北京地区HBoV2序列均不属于HBoV2A和HBoV2B亚型，而是位于一个新的HBoV2亚型分支上，表明北京地区HBoV2流行株为近年来出现的一种新的亚型。

有研究表明，HBoV存在型间重组[20]，Zhao等[19]报道了HBoV2A和HBoV2B存在亚型间重组。病毒序列重组可导致新的型别及亚型的出现，还可能导致病毒毒力及抗原性的改变。本研究中，北京地区流行的HBoV2毒株为一个新的亚型，其是否来源于HBoV序列的重组变异还须要进一步研究。