复方夏枯草对自身免疫性甲状腺炎大鼠Th1/Th2相关细胞因子的影响

金剑虹 刘国新 杨成 任兴昌 洪郁芝*

自身免疫性甲状腺炎（AIT）属于一种器官特异性疾病，其发病机制复杂，目前尚无统一的诊断标准，其以血清中大量甲状腺过氧化物酶抗体（TPOAb）伴或不伴甲状腺球蛋白抗体（TgAb）升高为主要表现，病理学常可见甲状腺组织中以淋巴细胞为主的细胞浸润［1］。近年来其发病率逐年上升，全世界发病率已接近1‰［2］。常用治疗方法有甲状腺激素替代治疗、糖皮质激素或免疫抑制剂治疗。研究发现，AIT发病机制可能与T细胞主导的Th1/Th2免疫失衡密切相关［3］。本文探讨复方夏枯草对EAT大鼠的疗效及对Th1/Th2相关因子的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康清洁级SD雌性大鼠40只，4～5周龄，体重90～110g，购于上海BK公司，动物合格证：SCXK（沪）2013-0116。饲养于浙江中医药大学动物实验中心，许可证号：SYXK（浙）2013-0184。

1.2 药物及试剂 猪甲状腺球蛋（PTg）、完全弗氏佐剂（CFA）、不完全弗氏佐剂（IFA）、碘化钠（NaI），以上试剂均为美国Sigma公司产品。大鼠TPOAb、大鼠TgAb、大鼠IL-2、大鼠IL-10ELISA试剂盒，以上试剂均为美国ASSAY 公司产品。磷酸缓冲盐溶液（PBS）。YJ-857型净化工作台、Bio-Tek ELX800全自动酶标仪、电子秤、37℃电热恒温箱、低温冰箱（-20℃、-80℃）、微量移液器，及小试管、离心管、玻璃器皿、吸水纸等。

1.3 动物模型建立 大鼠购入后适应性喂养7d，按参考文献［4-5］造模方法，对模型组大鼠饮用配制的0.064%高碘饮水（注意避光保存），食用普通饲料；每只大鼠予以0.2ml完全乳化制剂配制的（合PTg100μg）合剂，分别对其四肢内侧、颈部背部、足蹠等多处进行皮下注射，1次/周，共2次，此为初次免疫。第3周开始使用不完全乳化制剂配制的合剂0.2ml，继续按上述方法对大鼠进行多点皮下注射乳化抗原，1次/周，直至第8周结束，共8次，每次皮下注射注意更换至临近位置，整个免疫过程密切观察大鼠生命体征变化，及时做出调整。第8次加强免疫末，称取大鼠体重，按照随机数字表法，随机抽取3只造模大鼠，麻醉后行腹主动脉取血，离心采取血清进行TPOAb、TgAb指标检测。未干预大鼠（对照组）予以相同剂量的脂肪乳多点皮下注射，饮用蒸馏水及普通大鼠饲料。

1.4 实验动物及分组 造模成功后将造模组27只大鼠按随机数字表法均分为模型组、中药低剂量组、中药高剂量组三组，中药各组大鼠使用配制好相对应浓度的中药，按体重换算进行灌胃治疗（中药低剂量组予复方夏枯草4.675g/kg，中药高剂组予复方夏枯草9.35g/kg），模型组及对照组均使用按体重换算的蒸馏水灌胃治疗，注意大鼠的抓定及灌胃方法，同时密切注意大鼠一般情况变化，及时做出必要的调整。

1.5 观察指标 大鼠中药治疗8周后，戊巴比妥麻醉后进行腹主动脉采血，静置30min后3500r/min离心15min，获取血清，采用酶联免疫（ELISA）法检测大鼠血清TPOAb、TgAb、IL-2、IL-10水平。各指标检测方法大致相同，先后顺序为标准品加样、加样、加酶、温育、配液、洗涤、显色、终止、测定9个步骤，后在回归方程中计算出待测血清指标浓度。

1.6 统计学方法 采用IBM SPSS Statistics 21.0统计软件。计量资料以（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，组内比较采用配对样本t检验；非正态分布各组间比较采用非参数检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

干预过程中先后有4只大鼠因灌胃时食管破裂感染死亡，退出实验，其余大鼠持续至实验结束。

2.1 各阶段大鼠TPOAb、TgAb比较 （1）造模结束时，利用随机数字表法，从模型组30只大鼠中随机选取10只大鼠，与对照组比较，显示模型组两抗体水平均明显高于正常对照组（P＜0.01），提示本次实验造模成功。见表1。（2）中药干预4周时，中药低剂量组与模型组比较，TPOAb、TgAb显著降低（P＜0.01）；中药高剂量组与模型组比较，TPOAb、TgAb降低（P＜0.05）。（3）中药干预8周时，中药低剂量组、中药高剂量组与模型组比较，TPOAb、TgAb显著降低（P＜0.01）。见表2、3。

表1 模型组与正常对照组TPOAb、TgAb比较（±s）

表1 模型组与正常对照组TPOAb、TgAb比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05

组别 大鼠数（只） 血清TPOAb（IU/ml） 血清TgAb（IU/ml）模型组 10 11.28±1.79* 31.49±2.68*对照组 10 4.27±1.52 16.21±2.26

表2 中药干预4周时各组TPOAb、TgAb变化比较（±s）

表2 中药干预4周时各组TPOAb、TgAb变化比较（±s）

注：与模型组比较*P＜0.01，#P＜0.05

组别 大鼠数（只） TPOAb（IU/ml） TgAb（IU/ml）模型组 8 11.91±2.51 29.56±2.49中药低剂量组 8 8.90±1.33* 23.83±1.63*中药高剂量组 8 9.79±1.33# 24.12±1.49#

表3 中药干预8周时各组TPOAb、TgAb变化比较（±s）

表3 中药干预8周时各组TPOAb、TgAb变化比较（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.01

组别 大鼠数（只） TPOAb（IU/ml） TgAb（IU/ml）模型组 8 11.70±2.31 30.16±2.47中药低剂量组 8 7.10±1.38* 22.16±2.42*中药高剂量组 8 8.14±1.17* 21.58±2.03*

2.2 各阶段大鼠IL-2、IL-10比较 干预4周和8周时IL-2治疗组较模型组均有所缓解（P＜0.01）。而IL-10治疗组较模型组均有所升高（P＜0.01）。

表4 中药干预4周时各组IL-2、IL-10变化比较（±s）

表4 中药干预4周时各组IL-2、IL-10变化比较（±s）

注：与对照组，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01；▲P＜0.05

组别 大鼠数（只） IL-2（ng/L） IL-10（ng/L）模型组 8 269.50±26.70* 19.23±2.02*中药低剂量组 8 209.60±22.20# 24.06±2.51▲中药高剂量组 8 206.87±23.20# 22.97±3.43▲对照组 8 127.71±17.92 36.40±3.70

表5 中药干预8周时IL-2、IL-10变化比较（±s）

表5 中药干预8周时IL-2、IL-10变化比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01

组别 大鼠数（只） IL-2（ng/L） IL-10（ng/L）模型组 8 275.94±16.89* 19.28±1.38*中药低剂量组 8 181.19±20.89# 26.88±1.90#中药高剂量组 8 193.15±14.27# 26.80±2.46#对照组 8 137.30±9.64 35.17±1.45

3 讨论

自身免疫性甲状腺炎（AIT）是一种器官特异性疾病，发病率逐年增加，其发病机制复杂，目前尚无明确病因，推测其可能原因与基因、环境、生活饮食、工作压力增加等相关。通过经典的造模方法［4-5］多次定量皮下注射猪甲状腺球蛋白和持续高碘饮水作用于模型大鼠，检测大鼠血清TPOAb、TgAb水平，造模大鼠出现双抗体较对照组明显升高，提示EAT模型建立成功。

多数学者［6-7］认为Th1/Th2失衡是AIT发病的主要原因，若能在Th细胞亚群选择性分化前后进行干预，就有可能预防甚至终止AIT的发生和发展。已经证实存在多种细胞因子：IL-1α、IL-1b、IL-2、IL-4，IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、TNF-α和IFN-γ在炎症细胞和甲状腺滤泡细胞内，其中以表达IL-2和IFN-γ为主的Th1细胞可激发迟发型超敏反应，介导细胞免疫应答；以表达IL-4、IL-10、IL-13为主的Th2细胞可促进抗体产生，介导体液免疫应答。研究认为AIT患者的Th1/Th2细胞失衡往Th1方向偏离，本实验检测血清中白细胞介素IL-2、IL-10的变化，IL-2在造模结束时显示其较正常对照组明显升高（P＜0.01），在治疗干预4周和8周时治疗组较模型组均有所缓解（P＜0.01）。而IL-10有类似相反表现，在造模结束时显示其较正常对照组明显降低（P＜0.01），在治疗干预4周和8周时治疗组较模型组均有所升高（P＜0.01）。

在我国，中医有多种方剂用于AIT治疗［8］。其中夏枯草是比较重要的药物之一，夏枯草性寒，味甘、辛、微苦，富含苯丙素和三环萜类、黄酮、酚酸、多糖等，具有抗炎、抗菌、免疫调节、抗肿瘤、抗细胞毒、降血糖、抗病毒以及抗肿瘤等作用，其中免疫调节、抗炎抑菌作用比较突出，疗效较好［9-11］。黄芪主要成分是黄芪苷、黄芪多糖、氨基酸等，其中前两者占主要成分，实验研究发现黄芪苷具有抗感染、抗氧化、调节血糖、调节人体免疫力等作用。经研究发现其主要活性成分黄芪甲苷可以明显降低患者血液中IFN-γ和IL-10的水平，通过增强机体激素作用和免疫抑制剂的抑制作用，降低细胞凋亡的水平，调节T 细胞亚群，使Th1/Th2 细胞比例失衡趋于正常［12-14］。另外本方剂中牛蒡子、党参亦有一定程度的抗氧化、免疫调节的作用［15-17］。结合当前AIT发病机制的主流理论免疫失衡学说，以及各药的现代研究、本实验的治疗效果，推断夏枯草、黄芪、党参可能是从免疫调节方面达到治疗AIT目的，相关文献［12，16，18］也支持该观点。

综上所述，TPOAb、TgAb造模后的升高，干预后的降低，提示该复方制剂确实可以缓解AIT大鼠的免疫损伤，有一定的治疗效果。IL-2、IL-10的变化与文献［3］中提示的Th1/Th2失衡相符合，进一步论证AIT的Th1/Th2免疫失衡学说，亦证实复方夏枯草可以改善AIT大鼠的免疫失衡，达到治疗效果。而干预8周时较干预4周时各指标改善进度缓解，推测该复方制剂可能在早期干预疗效较佳，在之后一段时间呈现一定程度的平台期，继续干预可能会出现进一步的改善，其原因考虑AIT本身为易忽视的慢性疾病，早期较长一段时间可能呈现血清学改变，而病理学改变滞后，且可能滞后较长时间。