泌乳期母乳脂肪酸变化及其多不饱和脂肪酸影响因素

仲玉备，陈历俊，赵军英，董学艳，李菊芳，刘 斌，常兰兰，陈树兴,*，姜铁民,*

（1.河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023；2.国家母婴乳品健康工程技术研究中心，北京 100163；3.北京市乳品工程技术研究中心，北京 100163）

母乳是6 个月内婴儿最理想的天然食品，世界卫生组织提倡0～6 个月婴儿母乳喂养，且继续母乳喂养至1 岁以上[1]。母乳喂养不仅有助于婴儿生长发育，增进母子感情，还可促进母亲身体恢复[2]。母乳中含有3%～5%的脂肪，是婴儿营养的重要组成，可为婴幼儿生长发育提供45%～60%的能量，并且母乳脂肪酸作为生物活性物质影响婴儿中枢神经系统发育[3]，尤其是多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）与婴儿的生长发育直接相关，如作为PUFA前体物质的亚油酸（linoleic acid，LA）、α-亚麻酸（α-linolenic acid，ALA）可预防过敏和感染，并对婴儿视觉和认知发展具有重要意义，二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）可以帮助降低胆固醇含量，对心脑血管疾病有预防和治疗作用，还可促进人体内饱和脂肪酸代谢，二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）和花生四烯酸（arachidonic acid，AA）作为大脑中的主要结构性脂肪酸，在健康人脑组织的脂肪结构中分别占25%和15%，充足的DHA和AA供给是婴儿生长发育，尤其是神经系统及视力发育的重要保障[4-5]。

母乳脂肪酸的组成随泌乳期、母亲膳食、所在地区而变化[6-10]，还可能受胎次、孕周、母亲遗传背景等多种因素的影响[11-12]，但关于此方面的研究甚少。目前鲜见乳母血型、孕前身体质量指数（body mass index，BMI）、分娩方式、婴儿胎次等多个因素与母乳中重要PUFA关系的研究。因此，本实验通过气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技术对河南洛阳地区不同泌乳期母乳中脂肪酸的组成和含量进行系统研究，并进一步分析乳母血型、生育年龄、分娩方式和婴儿性别、胎次等对成熟乳中重要PUFA含量的影响，以期为科学模拟母乳开发婴幼儿配方食品及开展泌乳期母婴个性化膳食摄入研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象与乳样采集

于2015年10月—2016年1月，在河南洛阳5111医院、电力医院妇产科按“知情同意，自愿参加”原则，招募居住河南洛阳不低于1 a，分娩后仍居住在本地，无特殊偏食习惯，婴儿足月分娩、无先天性及遗传性疾病的健康汉族乳母，并签署知情同意书，定时用吸奶器采初乳（0～5 d）、过渡乳（12～14 d）、成熟乳（1～6 月），并放入－80 ℃超低温冰箱中进行冷冻保存，共收集样本240 份。

1.2 试剂与仪器

37 种脂肪酸甲酯混标 美国Sigma公司；去离子水及其他试剂均为色谱纯。

MIRIS HMA型母乳分析仪 瑞典MIRIS AB公司；TRACE1300-ISQ GC-MS联用仪 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；高速冷冻离心机 美国Sigma公司；旋涡振荡器 美国Scilogex公司；恒温水浴锅 余姚市东方电工仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 母乳脂肪含量测定

母乳脂肪含量采用母乳分析仪进行测定。

1.3.2 脂肪酸甲酯化

采用盐酸-甲醇法。取200 µL母乳，加入0.5 mol/L的盐酸-甲醇溶液5 mL，加入2 mL正己烷，2 mL甲醇，振荡混匀，在80 ℃恒温水浴振荡2 h，取出试管用流动水冷却至室温后，加入2 mL去离子水，振荡混匀后，于5 000 r/min冷冻离心5 min，吸取1 mL上层清液（酯层溶液）于进样瓶，进行GC-MS检测，检测前于－20 ℃保存[13]。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：HP-88气相色谱柱（100 m×0.25 mm，0.20 µm）；升温程序：初始温度60 ℃，保持5 min，以8 ℃/min升至160 ℃，然后以4 ℃/min升至200 ℃，保持5 min，最后以3 ℃/min升至240 ℃，保持5 min；进样器Thermo Scientific TriPlus RSH自动进样器；进样口温度200 ℃；恒流速模式1 mL/min；进样量1 µL；分流比10∶1；载气N2。

1.3.4 质谱条件

电子电离源；离子源温度280 ℃；传输线温度240 ℃；四极杆温度150 ℃；四极杆质量扫描范围m/z35～400。

1.3.5 脂肪酸定性定量方法

根据脂肪酸甲酯的质谱特征离子和保留时间定性，根据已知质量的脂肪酸甲酯混标定量。37 种脂肪酸甲酯混标总离子流色谱如图1所示、母乳样品（LY-DL003-3）的脂肪酸甲酯总离子流色谱如图2所示。

图1 37 种脂肪酸甲酯混标GC-MS总离子流色谱图Fig. 1 GC-MS total ion chromatograms of mixed standard of 37 fatty acid methyl esters

图2 母乳样品（LY-DL003-3）中脂肪酸甲酯GC-MS总离子流色谱图Fig. 2 GC-MS total ion chromatogram of human milk sample(LY-DL003-3)

1.4 数据分析

应用SPSS 23.0软件对乳母一般资料进行统计学描述；母乳基本信息中定量资料为非正态分布，数据用Median±IQR表示；脂肪及脂肪酸数据均通过正态性检验，数据用 ±s表示；多组数据间比较采用方差分析法，两组数据间比较采用t检验，正态分布变量用Pearson相关分析。将单因素分析中对母乳中重要PUFA含量有显著影响的因素，纳入线性回归分析[14]。所有统计检验均为双侧检验，P＜0.05，差异显著。

2 结果与分析

2.1 研究对象基本信息

乳母的生育年龄、体质量、身高、孕前BMI、血型及婴儿出生体质量、胎次等资料统计结果如表1所示。

表1 研究对象基本信息Table 1 Basic information about the study objects

2.2 母乳中脂肪含量

表2 不同泌乳阶段母乳脂肪质量浓度Table 2 Fat contents of breast milk at different lactation stages g/100 mL

由表2可知，初乳（0～5 d）中脂肪含量最低，过渡乳（12～14 d）中达到最高，初乳、过渡乳、成熟乳（1～6 月）中脂肪含量差异显著。

2.3 母乳中脂肪酸含量

本研究测定初乳、过渡乳、成熟乳中脂肪酸的组成及相对含量，共检测到37 种脂肪酸，多以偶数碳原子脂肪酸形式存在，其中饱和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）17 种，单不饱和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA）9 种，n-3系列PUFA 4 种，n-6系列PUFA 7种。如表3所示，总SFA含量随着泌乳期的延长而增加，并且维持在26.50%～46.62%范围内，在初乳与成熟乳中差异显著；中链饱和脂肪酸（medium chain saturated fatty acids，MCSFA）C10:0、C12:0在初乳中的含量较过渡乳、成熟乳低，差异显著；另外，C4:0、C11:0、C14:0、C15:0、C17:0、C20:0、C21:0、C24:0含量在各组间无显著差异。总MUFA质量分数在初乳中最高为37.14%，成熟乳中最低为33.67%；油酸是MUFA主要组成成分，随着泌乳期的延长含量逐渐降低，但差异不显著。总PUFA质量分数在初乳、过渡乳、成熟乳中分别为27.68%、27.31%、28.72%，组间差异不显著；初乳、过渡乳中n-6系列PUFA含量均较成熟乳中低，并且差异显著；LA是n-6系列PUFA的主要组成成分，在初乳、过渡乳中含量均显著低于成熟乳；AA质量分数在初乳中最高为0.83%，成熟乳中最低为0.66%；总n-3系列PUFA含量在各组间无显著差异，其中ALA、EPA在初乳中质量分数分别为1.85%、0.05%，均比过渡乳、成熟乳中的含量低，但是DHA含量在初乳中最高为0.68%。

表3 不同泌乳期母乳脂肪酸测定结果Table 3 Fatty acid composition of breast milk at different lactation stages%

续表3

2.4 成熟乳中5 种重要PUFA影响因素分析

2.4.1 乳母年龄对母乳PUFA的影响

表4 生育年龄与母乳中5 种PUFA相关性Table 4 Correlation analysis of childbearing age and the contents of five PUFAs in breast milk

如表4所示，乳母年龄与母乳中5 种PUFA含量之间不存在相关性。

2.4.2 乳母孕周对母乳PUFA的影响

表5 孕周与母乳中5 种PUFA相关性Table 5 Correlation analysis of gestational age and the contents of five PUFAs in breast milk

由表5可知，足月胎儿孕周的长短与母乳中5 种PUFA之间不存在相关性。

2.4.3 婴儿胎次对母乳PUFA的影响

表6 婴儿胎次对母乳5 种PUFA影响Table 6 Effect of parity on the contents of five PUFAs in breast milk

根据婴儿的胎次，将纳入研究的乳母分为2 组，头胎、二胎，由表6可知，两组间差异无统计学意义，但生头胎的乳母母乳中5 种PUFA的含量均比生二胎的高。

2.4.4 婴儿性别对母乳PUFA的影响

根据乳母分娩的婴儿性别，将纳入研究的乳母分为2 组，男婴、女婴组，由表7可知，乳母母乳中LA含量在男女婴组间有显著差异，并且女婴组含量高于男婴组。ALA、AA、EPA、DHA含量在男女婴组间差异无统计学意义。

表7 婴儿性别对母乳5 种PUFA的影响Table 7 Effect of infant sex on the contents of five PUFAs in breast milk

2.4.5 分娩方式对母乳PUFA的影响

将纳入研究的乳母按分娩方式分为顺产、剖腹产2 组，由表8可知，剖腹产组5 种PUFA含量均比顺产组高，但差异不显著。

表8 分娩方式对母乳5 种PUFA的影响Table 8 Effect of delivery modes on the contents of five PUFAs in breast milk

2.4.6 乳母血型对母乳PUFA的影响

根据乳母血型，将纳入研究的乳母分为4 组，A型、B型、AB型、O型，由表9可知，AB血型乳母母乳中AA、EPA、DHA含量均高于其他血型，并且具有统计学意义，LA、ALA含量在不同血型乳母母乳中差异不显著。

表9 乳母血型对母乳5 种PUFA的影响Table 9 Effect of maternal blood types on the contents of PUFAs in breast milk

2.4.7 乳母产前BMI对母乳PUFA的影响

依据“中国肥胖问题工作组”提出我国成人BMI标准，将纳入研究的乳母按孕前BMI分成4 组，消瘦（≤18.5）、正常（18.5～23.9）、超重（24～27.9）、肥胖（≥28）。由表10可知，产前超重组乳母母乳中ALA、DHA含量均高于消瘦、正常、肥胖组，并且差异显著，LA、AA、EPA含量在4 组间差异不显著。

表10 乳母产前BMI对母乳5 种PUFA的影响Table 10 Effect of prenatal BMI on the contents of five PUFAs in breast milk

以母乳LA含量（Y1）为因变量，以单因素分析得到的对其有显著影响的婴儿性别（X1）为自变量，进行线性回归分析，得回归方程为：Y1=27.160－2.487X1，X1=1（女）、2（男），R2=0.052，P=0.022，说明LA水平的变异可由自变量解释5.2%，男婴乳母母乳中LA含量低于女婴母乳中的，与单因素分析结果一致；以母乳ALA含量（Y2）为因变量，以单因素分析中对其有显著影响的乳母孕前BMI（X2）为自变量，进行线性回归，得回归方程为：Y2=1.646＋0.405X2，X2=1（≤18.5）、2（18.5～23.9）、3（24～27.9）、4（≥28），R2=0.045，P=0.036，说明ALA水平的变异可由自变量解释4.5%，BMI与母乳ALA含量呈正相关，整体BMI越大，ALA含量越大，与单因素分析结果基本一致；以母乳DHA含量（Y5）为因变量，以单因素分析中对其有显著影响的乳母孕前BMI（X2）、乳母血型（X3）为自变量做多元线性回归，纳入方程的只有乳母孕前BMI（X2），得到回归方程Y5=0.188＋0.079X2，X2=1（≤18.5）、2（18.5～23.9）、3（24～27.9）、4（≥28），R2=0.089，P=0.024，说明DHA水平的变异可由自变量解释8.9%，BMI与DHA含量呈正相关，整体与单因素分析结果一致；以母乳AA含量（Y3）为因变量，以单因素分析有显著影响的乳母血型（X3）为自变量，进行回归分析，得回归方程：Y3=0.616＋0.002X3，X3=1（A）、2（B）、3（AB）、4（O），R2=0.026，P=0.917，P值大于0.05，说明AA和乳母血型间线性关系不显著；以母乳中EPA含量（Y4）为因变量，以单因素分析有显著影响的乳母血型（X3）为自变量，进行回归分析，得回归方程：Y4=0.188＋0.011X3，X3=1（A）、2（B）、3（AB）、4（O），R2=0.001，P=0.281，P值大于0.05，说明EPA和乳母血型间线性关系不显著。

3 讨 论

本研究采用GC-MS联用技术测定河南洛阳地区母乳脂肪酸的组成，并探讨乳母母乳中对婴儿发育具有重要作用的5 种PUFA LA、ALA、AA、EPA和DHA含量的影响因素。

母乳中脂肪及脂肪酸含量呈动态变化。初乳中脂肪含量最低，过渡乳中最高，成熟乳中趋于稳定，脂肪的变化，尤其是早期的变化是为了适应新生婴儿消化器官发育尚不完善，胃肠功能差的状况，摄入含过多脂肪的母乳会引起生理腹泻。母乳中SFA、MCSFA（C10:0、C12:0）的含量随着泌乳时间的延长而逐渐增加，与国内外其他报道中各种脂肪酸所占的比例范围类似[7,9,15]。不同泌乳阶段中MUFA含量差异不显著，其中成熟乳中MUFA含量（33.67%）高于日照（32.27%）和徐水（29.28%），但低于江苏句容地区（37.52%）[16]，油酸是婴幼儿所需能量的重要来源及组织和细胞膜结构的重要组分[17]，是母乳中含量最高的MUFA，而且在初乳中含量最高，这可能是由于婴幼儿生长发育初期，组织、器官生长发育旺盛，对能量需求较高[18]，另外，在不同的泌乳期均检测到芥酸（C22:1），可能与河南洛阳地区人们普遍食用菜籽油有关，还需进一步研究。初乳、过渡乳中PUFA的含量与北京地区相当，成熟乳中PUFA含量较北京地区高[9]。n-6系列PUFA中的LA和n-3系列PUFA中的ALA是人体必需脂肪酸，可通过脱氢和碳链延长分别合成AA、DHA，欧洲儿科胃肠病学和营养学会推荐母乳中LA/ALA理想范围为5～15，本研究中各泌乳期LA/ALA比例较适宜。初乳中AA、DHA含量最高，并且随着泌乳期的延长显著下降，与刘静[6]、Weiss[19]等的研究一致。这是由于胎儿期和新生儿早期，AA和DHA通常在胎儿及婴儿大脑中大量聚集，以促进大脑细胞的分化及视网膜的正常发育，虽然DHA和AA在体内可分别由ALA和LA合成，但此时婴儿体内的脂肪酸碳链延长酶和去饱和酶活性较低，合成能力有限，其体内的DHA和AA多半是孕期经胎盘及产后经母乳得来[20]，随着婴幼儿发育的成熟，自身合成能力的提高，母乳中AA、DHA含量逐渐下降。

对可能会影响母乳中5 种PUFA含量的7 个因素分析发现，母乳中LA含量与婴儿性别有关，女婴乳母组母乳中LA含量显著高于男婴乳母组。孕前超重乳母母乳中ALA、DHA含量显著高于其他3 组，另除LA外，超重组、肥胖组乳母母乳中其他4 种PUFA，ALA、AA、EPA、DHA含量均较消瘦组、正常组高，这可能由于PUFA与促进代谢有关，可使心血管疾病风险降低，是对后代心脏的保护机制[21]。AB血型乳母母乳中AA、EPA、DHA含量均高于A型、B型、O型血乳母母乳中含量，差异具有统计学意义，血脂是乳母母乳脂肪酸的重要来源，研究表明非O型血人群血脂浓度较高[22]，这可能是AB血型乳母母乳中AA、EPA、DHA含量较其他血型乳母高的原因，另外，本研究中B型血乳母母乳中总脂肪酸含量也显著高于O型血乳母。分娩方式对5 种PUFA含量均无显著影响，但剖腹产乳母母乳中5 种PUFA含量均高于顺产乳母，可能是由于剖腹产乳母产后伤口愈合需要大量的热能和蛋白质，更加注重膳食营养搭配。生头胎乳母母乳中5 种PUFA含量与生二胎乳母相比，差异不显著，但是生头胎的乳母母乳中5 种PUFA含量均较生二胎的高，可能是由于生二胎的乳母合成PUFA能力较生头胎乳母弱造成的[12]。乳母孕周、生育年龄不影响5 种PUFA的组成，与Esther等[23]的研究一致。Guerra等[24]对早产和足月分娩乳母母乳研究时发现由于早产儿自身组织中PUFA存储量较少，并且对LA、ALA碳链延长和去饱和能力弱，其乳母母乳中PUFA含量显著高于足月分娩乳母。Argovargaman等[25]研究显示孕周只影响年龄较大乳母（＞37 岁）过渡乳中n-3、n-6系列脂肪酸的组成，另外，产妇年龄在怀孕后期会以脂肪含量和组成的形式影响母乳的成熟[26]，并且随着怀孕和分娩年龄的增高，母亲和孩子会有健康与代谢问题，如增加母亲患高血压、糖尿病的风险，同时也会导致早产和低体质量儿的出生[27]，从母婴健康角度考虑，应适龄生育。母乳中PUFA含量与编码哺乳动物长链脂肪酸延长酶基因ELOVL1-ELOVL7有关[28-29]，另外，林麒等[30]的研究表明，母乳脂肪酸含量还与社会因素有关。对于造成女婴乳母母乳中LA含量显著高于男婴乳母的原因，需要结合乳母基因型及社会因素等进行深入研究。另外，由于本研究资料信息收集有限，乳母孕期体质量的增加、产后体质量的变化、睡眠等是否也会对母乳中5 种PUFA含量造成差异也需要进一步研究。

总之，为满足婴幼儿生长发育的需求，母乳中各种脂肪酸特别是PUFA含量随着泌乳时间的延长而不断发生着变化，并且母乳中与婴儿生长发育至关重要的PUFA受不同因素的影响。因此，在进行新生儿喂养以及配方奶粉的配制时应充分考虑脂肪酸等营养素的微观变化及乳母遗传背景、身体状况等，使之更符合婴幼儿的营养需求。