母猪头胎乳头利用时间是否影响第二胎乳腺组织的泌乳量和基因表达

周琳

摘 要：最近的研究表明，母猪在第一胎中未被仔猪吮吸利用的乳头在第二胎中会发育不良且泌乳量下降。本研究将研究在首个泌乳期中母猪乳头分别吮吸2 d、7 d和21 d对第二胎中所产仔猪生长性能、乳成分、母猪内分泌和乳腺组织基因表达的影响。妊娠的头胎大白母猪根据泌乳期分为3组：1） 泌乳期2 d（组号“2D组”，母猪20头）；2） 泌乳期7 d（组号“7D组”，母猪20头）；3） 泌乳期21 d（组号“21D组”，母猪21头）。断奶后，母猪正常饲养直至第二胎。在这两个胎次的泌乳期内，每头母猪的带仔数均调整为12头和12个功能乳头，多余的乳头封印处理。在第二胎的泌乳期内，记录母猪的采食量，同时在出生后第2、7、14、21、31和56天分别对仔猪称重。在第二胎妊娠的第110天和泌乳期的第21天，每个处理组取10头母猪的乳腺薄壁活体组织检测PRL、PRLR-LF、STAT5A、STAT5B、LALBA和IGFBP-5基因mRNA豐度，同时采集乳汁和颈静脉血液样本，分析乳的标准组成成分（干物质、脂肪、蛋白和乳糖），测定血液中催乳素、IGF-1、葡萄糖和尿素浓度。结果表明，在第二胎泌乳期的第1周，与2D组和7D组母猪相比，21D组母猪采食量有升高的趋势 （P<0.10）；在第56天之前，不同处理组在仔猪体重及母猪乳汁的干物质、脂肪、蛋白和乳糖含量上均无显著的差异（P>0.10）。在第二胎泌乳期的第110天，21D组母猪乳腺组织的PRL表达水平高于7D组的母猪；在第21天，7D组母猪乳腺组织STAT5B的表达水平高于2D组的母猪（P<0.05），而IGFBP-5的表达水平往往低于后者（P<0.10）；2D组母猪乳腺组织LALBA的表达水平低于7D组母猪。本文研究结果表明，母猪首个泌乳期期乳头被仔猪吮吸时间从2 d增加到7 d或21 d不会影响其第二胎所吮吸仔猪的生长速度。这说明在第一胎中让母猪乳头接受2 d的仔猪吮吸足以确保母猪乳腺的良好发育。

关键词：基因表达；泌乳期；泌乳量；胎次；母猪；乳头吮吸

中图分类号：S814.7 文献标志码：C 文章编号：1001-0769（2018）04-0037-06

决定哺乳仔猪生长速度的主要因素是它们摄入的母乳量，而母猪的泌乳量又受制于启动泌乳时乳腺中乳腺细胞的数量（Head和Williams，1991）。妊娠的最后三分之一时间是母猪乳腺快速发育的阶段（S?rensen等，2002），这种发育在整个泌乳期会一直持续。有报道称，哺乳仔猪从哺乳期的第5天到第21天，其体重平均提高57%（Kim等，1999）。在仔猪断奶后，母猪乳腺快速萎缩，进而退化到休眠状态（Monks等，2002）。在断奶后的7 d中，母猪乳腺实质组织重量会减少三分之二以上（Ford等，2003）。萎缩后，乳腺组织会在下一胎的妊娠期再次发育。

仔猪的吮吸对乳腺组织维持泌乳功能极为重要（Farme，2013），否则乳腺组织在泌乳期间也会发生萎缩（Theil等，2006）。这种萎缩在 3 d后是不可逆的，且会引起乳腺基因表达的改变。最新的研究表明，在第一胎泌乳期间未被仔猪吮吸利用的乳头在第二胎中会出现发育不良且泌乳量下降。吮吸第一胎被用过乳头的仔猪在56日龄时体重比吮吸早先未被用过乳头的仔猪重1.12 kg（Farmer等，2012）。该最近的研究还证明，头胎期间被吮吸过的乳头其乳腺实质组织中催乳素mRNA相对丰度有增高的趋势。但仍有部分问题留有疑问：头胎时乳头最短需要吮吸多长时间才不会影响该乳头在第二胎的泌乳量？本研究的目的是明确头胎期间母猪乳头分别接受2 d、7 d和21 d的吮吸时间对第二胎中的仔猪生长性能、内分泌状态和母猪乳腺组织基因表达的影响。

1 材料与方法

1.1 试验母猪和分组

试验选择有14个功能性乳头的61头初产大白母猪，用长白公猪精液实施人工授精，饲喂至分娩。随后根据泌乳期长短，61头母猪随机分为3组：（1） 泌乳期2 d（ 组号“2D 组”，母猪20 头）；2） 泌乳期7 d（ 组号“7D 组”，母猪20 头）；3） 泌乳期21 d（ 组号“21D 组”，母猪21 头）。断奶后，母猪按照正常生产流程饲养至第二胎分娩。在两个胎次的泌乳期间，各母猪的带仔头数于分娩后12 h内标准化到12头（根据平均窝重调整）。在标准化时，第一胎每头仔猪只允许吮吸1个乳头，剩余乳头用胶带封隔。在第二胎的泌乳期内中，第一胎中封隔的乳头依旧封隔，且也不增加封隔的乳头，即使有仔猪死亡也如此。在第二胎的泌乳期内，仔猪在出生后48 h（窝仔猪数标准化后）、第7天、第14天和第21天（断奶）、第31天和第56天分别称重。仔猪在断奶前不补充教槽料以保证其增重真实反映了母猪的泌乳量，记录断奶前的死亡率。在第二胎泌乳期的第21天，先将母猪与仔猪隔离45 min后，再给母猪静脉注射1.0 mL催产素，随后分别选定前、中、后三个有正常泌乳功能的乳头人工挤奶收集猪乳样本，测定乳中的干物质、脂肪、蛋白和乳糖含量；同时取所有母猪的颈静脉血液样本，测定催乳素、胰岛素样生长因子（Insulin Like Growth Factor 1，IGF-1）、葡萄糖和尿素的浓度。

在两个妊娠期中，母猪均饲喂常规的玉米-豆粕型商品日粮，其中粗蛋白14.3%、消化能3 266 kcal/kg、赖氨酸0.75%。头胎母猪饲喂量为2.5 kg/d，二胎母猪饲喂量为3.0 kg/d，每天07：00饲喂1次。在两个哺乳期中，母猪饲喂常规的玉米-豆粕型商品日粮，其中粗蛋白17.6%、消化能3 459 kcal/kg、赖氨酸1.0%，每天09：00饲喂1次。母猪在分娩当天饲喂3 kg日粮，从分娩后第2天至断奶期间实行自由采食。在第二胎的泌乳期，每天对余料进行称重以计算采食量。第一胎的母猪从断奶至配种期间自由采食相同的哺乳期饲料，哺乳母猪于妊娠期第110天转入周转性分娩栏内（1.8 m×2.4 m）。断奶时，同窝仔猪整体饲养在1.2 m×3.0 m的栏内直至56日龄，期间饲喂4种商品日粮（表1），自由采食与饮水。实验日期从2013年10月至2015年4月。

1.2 血液样本处理与检测

在早上喂料前采集颈静脉血，以测定催乳素、IGF-1、葡萄糖和尿素的浓度。催乳素浓度测定参照Robert等（1989）的方法进行。直接购买标记的催乳素和催乳素的一抗抗体，检测前确认哺乳母猪混合血液样本的有效性，平行性和平均回质率均为98.3%，检测灵敏度为1.5 ng/mL，组内和组间变异系数分别为4.47%和2.79%。购买人用IGF-1浓度检测盒，检测灵敏度为0.10 ng/mL，组内和组间变异系数分别为4.58%和1.17%。采用商品试剂盒的酶解比色法检测葡萄糖，组内好组间变异系数分别为1.32%和0.42%。尿素测定参照Huntington等（1984）的方法使用自动分析仪用比色法测定，组内和组间变异系数分别为2.58%和0.46%。

测定全奶的干物质、蛋白、脂肪和乳糖含量。干物质测定采用送风定温干燥法；蛋白采用微量凯氏定氮法重復测定；脂肪采用乙醚萃取法提取；乳糖利用商业试剂盒以比色法测定。组内和组间变异系数分别为1.38%和0.71%。

1.3 乳腺活组织检查

在第二胎的妊娠期第110天和哺乳期第21天，采集10头母猪的功能性乳腺的薄壁组织样本。乳腺活组织样本检查参照Kirkwood等（2007）的方法，与之不同的环节是母猪通过 8 mL～10 mL的麻醉预混剂和15 mL氮哌酮麻醉处理，然后每个乳头采集50 mg组织样本。活组织样本置于含有1 mL RNAlater的2 mL管内，4 ℃放置过夜，再于-80 ℃冻存后测定催乳素（PRL）、催乳素长型受体（PRLR-LF）、信号转导和转录激活因子（STAT5A和STAT5B）、α-乳白蛋白（LAIBA）和IGFBP-5的基因丰度。

1.4 RNA提取、DNA合成以及选定基因的实时PCR扩增

50 mg乳腺组织置于1 mL peq GOLD TriFast内，采用1.0 mm玻璃珠匀浆处理，总RNA根据试剂盒说明书用Direct-zolRNA miniPrep试剂盒提取。RNA数量和纯度分别在260 nm和280 nm吸收光波下用NanoDrop ND 2000分光光度计测定吸光值。cDNA反转录体系含0.25 μg总RNA、M-MLV反转录RNAaseH-、点突变和随机六聚体引物。mRNA丰度以实时定量聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）测定，反应体系含有SensiMix SYBR-Green、5 pmol正向引物和5 pmol反向引物。其中看家（内参）基因（GAPDH和泛素）和待检测靶基因均根据之前报道序列（PRL、PRLR-LF、LAIBA和IGFBP-5）人工合成。以Rotor Gene 软件进行阈值分析，靶基因表达以内参基因进行标准化处理，其公式如下：△Ct=Ct靶基因 - Ct内源对照（各个内参基因的平均Ct值）。

1.5 统计分析

采用SAS统计软件中的MIXED程序进行统计分析。其中激素和代谢产物数据以及乳成分和实时定量PCR数据采用单因素方差分析，包括处理效应和残差分析。重复测量方差分析，包括处理组内误差（相同处理组内母猪间的误差）和天数（残差误差）以及处理组×天数对采食量和仔猪体重的协同效应。对每天的上述变量进行独立方差分析。不同处理组间分娩后24 h（窝标准化以后）直至断奶期间的仔猪死亡率以非参数Wilcoxon检验进行对比分析。本文文中和表格内数据除特别注明外，均以最小二乘均数±最大标准误表示。P≤0.1作为趋势判断标准，P≤0.5作为显著性差异判断标准。

2 结果

母猪泌乳期间各周的每日平均采食量及仔猪的体重和体增重如表2所示。Repeated-in-time分析表明母猪采食量受哺乳时间的影响（P<0.001）而不同的处理组间无显著差异（P>0.10）。每周分析结果表明，在哺乳期的第一周，21D组母猪的采食量有高于2D和7D组母猪的趋势 （P<0.10）；不同处理的仔猪体重及增重在56日龄前无明显差异（P>0.10）。2D、7D和21D组仔猪出生后24 h至断奶期间的死亡率分别为6.70%、11.22%和9.52%；与2D组相比，7D组的仔猪死亡率具有升高的趋势（P<0.10）；2D、7D和21D组窝仔猪死亡头数分别为0.80、1.33和1.10头。

表3所示为泌乳期第21天血液中催乳素、IGF-1、尿素和葡萄糖的浓度，不同处理间无明显差异（表3）。此外，在泌乳期第21天，不同处理间的乳成分（干物质、脂肪、蛋白和乳糖）含量也无明显不同（P>0.10）（表4）。

Repeated-in-time分析显示，在妊娠期第110天和泌乳第21天，不同处理组的母猪乳腺薄壁组织中PRL、PRLR-LF、STA5A、STA5B、LALBA和IGFBP-5基因的mRNA相对丰度存在显著的采样日效应（P<0.01）（表5）。与泌乳期第21天相比，妊娠期第110天时的PRL、PRLR-LF、STA5A、STA5B和IGFBP-5表达水平更高，而LALBA则更低。在妊娠期第110天，不同处理对PRL表达水平的影响显著不同（P=0.05），21D组母猪显著高于7D组母猪。在泌乳期第21天，该效应不再存在，但7D组母猪的STA5B基因表达水平高于2D组母猪（P=0.05），而IGFBP-5表达水平有低于2D组母猪的趋势（P<0.10）。2D组母猪的LALBA mRNA丰度也出现了低于7D组母猪的趋势（P<0.10）。

3 讨论

早期研究结果表明，第一胎的哺乳期中没有被启用的乳头会对第二胎时吮吸该乳头的仔猪的生长产生不良的影响（Farm等，2012）。这就引发了在第一胎的泌乳期中乳头必须被吮吸多少时间才不会影响第二胎的泌乳期吮吸该乳头仔猪生长速度的疑问。本文的研究结果首次证明了第一胎中哺乳时间从2 d延长到7 d或21 d并不会提高下一个哺乳期中仔猪的生长速度。这表明在第一胎的哺乳期中乳头持续吮吸 2 d足以使乳腺得到充分的发育和基因表达，从而在第二胎的哺乳期中不会对泌乳量产生不良的影响。

本研究的实验模型不同于Farmer等（2012）所用的模型：在本研究中，处理组是针对第一个哺乳期的所有乳腺组织，而之前研究是针对特定的乳头。虽然仔猪吮吸按摩程度与会影响母猪泌乳量的激素状态（如催产素的释放）之间有着一定的相关性，但仔猪的断奶体重主要还是取决于单个乳腺组织泌乳量的差异（Fraser等，1979）。实际上，每一个乳腺组织的乳合成组织独立于其相邻的乳腺组织，单头仔猪的增重与其所吮吸的乳腺重量存在相关性。此外，泌乳期间乳腺发育似乎在乳腺水平上调节着。

仔猪吮吸刺激对乳腺发育和泌乳量的重要性最近才被提出。Theil等（2005）指出，泌乳早期连续3 d未被吮吸的乳腺会發生不可逆的萎缩，而1 d未被吮吸的乳腺则可以恢复但整个哺乳期的泌乳量会低于经常性吮吸的乳腺（吮吸这些乳腺的仔猪体重会下降23%）。与经常性被仔猪吮吸的乳腺组织相比，1 d或3 d未被仔猪吮吸的乳腺其基因的表达会改变，PRLR mRNA和LALBA mRNA被下调，而IGFBP-5 mRNA则会被上调。这些改变在被仔猪停止吮吸1 d但不是3 d的乳腺组织中是可逆的。因此，乳头停止使用的时间对乳腺组织中乳腺基因的表达具有重要的影响。Farmer等（2012）的研究结果表明，乳头的停止使用可能存在延滞效应，从而对下一个哺乳期的泌乳产生负面影响。

研究显示，分娩后仔猪吮吸的持续时间对于维持母猪每个乳腺组织的泌乳至关重要。当接受短暂吮吸（如12 h～14 h）的乳腺与未被仔猪吮吸或经常性接受吮吸的乳腺相比较时，接受短暂吮吸和未接受吮吸的乳腺组织均会发生萎缩，因此无法维持正常的泌乳功能。另一方面，在上述两种情况下，乳腺细胞的增殖诱导至少需要6 d，表明12 h～14 h的吮吸时间足以使乳腺能够维持与泌乳早期接受经常性吮吸的乳腺组织相近的乳腺细胞增殖速度。这些发现非常有意义，因为它们证明了产后早期仔猪吮吸的一个长期效应。同时，乳腺组织的基因表达同样存在着重大变化：与分娩后接受经常性吮吸的乳腺相比，未接受吮吸和短暂接受吮吸的乳腺组织中PRLR mRNA丰度降低而IGFBP-5 mRNA丰度则升高。因此，研究人员得出结论，高水平的催乳素受体转录和低水平的IGFBP-5转录对于乳腺维持泌乳功能非常重要。这与Tonner等（2000）的研究结果一致，后者报道IGFBP-5参与了引发乳腺萎缩的生理过程。本文的研究结果显示，在第二胎的泌乳期，21D组母猪在妊娠期第110天PRL mRNA丰度增加，而2D组母猪在泌乳期第21天乳腺中IGFBP-5的基因表达水平升高。因此，仔猪吮吸的持续性对下一个胎次母猪乳腺薄壁组织的基因表达具有延滞效应。2D组母猪在第二胎泌乳期第21天时LALBA基因的mRNA表达的下降趋势也证实了该假设，但已观测到对乳腺基因表达的作用还不足以引起仔猪增重的改变。

本研究关于乳腺薄壁组织中LALBA mRNA表达与Theil等和VanKlompenberg等（2013）的研究结果一致，他们报道由于乳合成能力的提高妊娠后期至泌乳早期LALBA基因表达水平大幅提高。就我们所知，本研究是首次报道妊娠后期PRL、PRLR-LF、STA5A、STA5B和IGFBP-5等基因mRNA丰度提高。Theil（2006）报道，PRLR基因表达在妊娠后期和泌乳早期之间没有变化，而IGFBP-5的基因表达只有略微的提高。产生这种不一致结果的原因还不清楚，但考虑到催乳素参与了乳腺发育，且在妊娠后期启动泌乳，当前的研究结果并不出人意料。

本文研究结果显示不同处理方式对乳成分组成没有影响，这与之前的研究结果一致，即第二胎的功能性乳头（在第一胎中不论是否被吮吸过）所分泌的乳汁在组成上均无差异（Farmer等，2012），考虑到本研究中所有乳头在第一胎时都至少被吮吸2 d，因此乳成分不会产生差异。唯一一个调查在第一胎时未被吮吸的乳头对其在第二胎中泌乳能力影响的研究没有测定乳的成分（Fraser等，1992）。催乳素对维持母猪泌乳的重要作用已经得到证明，在本研究中，泌乳后期血液中催乳素、IGF-1、尿素和葡萄糖的浓度没有变化，与母猪有相近的泌乳量、乳成分组成和采食量相符合。

综上所述，Theil等（2006）证实，分娩后前12 h～14 h的吮吸不足以启动和维持母猪的泌乳，因此，规律性吮吸才能维持母猪的持续泌乳。但分娩后启动泌乳所需要的最短吮吸时间没有测定。本研究结果表明，分娩后持续48 h的规律性吮吸足以启动母猪的泌乳过程，这样下一个胎次的泌乳不会受到负面影响（Farmer等，2012），本文的研究结果对头胎母猪的生产管理极为重要。