麦胚对高盐稀态酱油理化特性及抗氧化活性的影响

张欢欢，耿予欢*，李国基，王国树，杨君媚，谢京明

（华南理工大学食品科学与工程学院，广东 广州 510640）

小麦胚芽又称麦粉、麦胚，约占小麦籽粒的2%～3%，是麦粒中营养价值最高的部分，被称为“人类天然的营养宝库”[1]。麦胚不仅含有丰富的碳水化合物、蛋白质、脂类物质等基本营养成分，还含有多种生理活性物质，包括不饱和脂肪酸、谷胱甘肽、麦胚凝集素、黄酮类物质及VE等[2]。我国的小麦总产量约1.10亿 t，位居世界第1位，可以开发利用的麦胚潜藏量高达 200～300万 t[3]。由于麦胚含不饱和脂肪酸易氧化，且含较多色素，影响面粉的贮存稳定性及色泽等，在制粉加工过程中往往被除去充当饲料出售[4]，少数通过再加工处理作为填充料加入饼干、面包等食品中。重视及加速麦胚的综合开发，可提高其利用价值，使小麦加工企业的副产品增值，带来巨大的经济效益和社会效益。

许多研究[5]表明，麦胚经酵母菌发酵的产品具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌和抗炎等作用。伍娟等[6]发现，脱脂麦胚经乳酸菌发酵后，可提高其麦胚水溶性组分中可溶性蛋白、总酚含量，并与其羟自由基清除能力存在较好的对应关系。郑志强[7]、Zhu Kexue[8]等研究发现麦胚蛋白酶解物在多种体外抗氧化体系中均表现出较强的抗氧化活性。张家艳等[9]研究结果表明，发酵麦胚提取物对人结肠癌荷瘤裸鼠具有显著的抑瘤作用。因此，开发麦胚发酵产品的前景十分广阔，利用麦胚酿造酱油，替代传统酱油原料，将提高麦胚附加值，对提高酱油的综合品质具有重大意义。

目前酱油行业中使用的全麦粉虽含有一定量的麦胚，但关于麦胚具体添加量对酱油的品质研究比较少，关于麦胚对酱油抗氧化活性的影响更是缺少参考依据。本研究以黄豆、面粉及麦胚按一定配比发酵制备高盐稀态酱油，探究麦胚添加量对酱油品质及其抗氧化活性的影响，为使用新原料制备酱油及提高酱油抗氧化活性提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄豆、面粉、小麦胚芽、米曲霉（沪酿3.042）李锦记（新会）食品有限公司。

奎诺二甲基丙烯酸酯（Trolox）、2,2’-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS）、二苯基苦基苯肼（1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl，DPPH）、2,2’-氮二异丁基脒二盐酸盐、荧光素钠、福林-酚、没食子酸、芦丁，其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

FE-20 pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；KDN-102F定氮仪 上海纤检仪器有限公司；SHZ-D（III）循环水式真空泵 巩义予华仪器有限公司；IKA旋涡混合器 上海川翔生物科技有限公司；UV-2100紫外-可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；SpectraMax M2多功能酶标仪 美国Molecular公司。

1.3 方法

1.3.1 酱油的工艺流程及制作条件

精选的大豆→浸泡→滤水后加小麦胚芽→蒸料→冷却→加辅料面粉→接种米曲霉制曲→翻曲→成曲→制醅发酵→滤油→生酱油整个过程相对湿度控制在85%～90%左右。制曲结束后，称取成曲，按添加量为成曲的2.3 倍添加质量分数为20%的盐水，常温发酵150 d，压榨、过滤得生酱油。每个样品平行酿造3 缸。

1.3.2 基本理化指标分析

粗蛋白测定：参照GB 5009.5—2010《食品中蛋白质含量的测定》，采用凯氏定氮法；粗淀粉测定：参照ZB 66027—1987《粗淀粉测定法》，采用酸水解法；水分测定：参照GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》，采用直接干燥法；脂肪测定：参照GB 5009.6—2016《食品中脂肪的测定》，采用索氏抽提法；氨基态氮测定：参照GB/T 5009.235—2016《食品中氨基酸态氮的测定》，采用甲醛滴定法；总氮测定：参照GB 18186—2000《酿造酱油》，采用凯氏定氮法；还原糖测定：参照GB/T 5009.7—2016《食品中还原糖的测定》，采用直接滴定法；总酸测定：参照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》，采用酸碱滴定法；中性蛋白酶活力测定：参照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力测定法》，采用福林-酚法；糖化酶活力测定：参照GB8276—2016《食品添加剂糖化酶制剂》，采用还原糖法。

1.3.3 总酚、总黄酮含量测定

1.3.3.1 总酚的测定

酱油总酚的定量参考Xu等[10]的方法，略有修改。分别取1.0 mL酱油稀释液、没食子酸标准液于20 mL试管中，加蒸馏水至5.5 mL，摇匀，加入0.5 mL福林-酚，室温静置10 min，再加入7.5% Na2CO3溶液4 mL，充分摇匀，室温静置2 h，在765 nm波长处测定吸光度，结果以每100 mL酱油中含有的没食子酸当量表示（mg/100 mL）。以没食子酸质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程：y＝0.116x－0.003（R2＝0.999）。

1.3.3.2 总黄酮的测定

酱油总黄酮的定量参考Dewanto等[11]的方法，略有修改。取2 mL酱油于15 mL比色管中，用甲醇稀释至6 mL，8 000 r/min 离心15 min，取离心上清液1 mL，用70%乙醇溶液补足至体积为5 mL，后各加入0.3 mL质量分数5%的NaNO2溶液，混合静置5 min，再加入0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液，混合后静置6 min，加入4 mL 1 mol/L NaOH溶液，0.4 mL 30%乙醇溶液至体积为10 mL，混合后静置10 min，在510 nm波长处测定吸光度，结果以每100 mL酱油中含的芦丁当量表示（g/100 mL）。以芦丁为标准品，按照上述测定样品方法测定标准品吸光度，以芦丁质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程：y＝0.811x＋0.006（R2＝0.999）。

1.3.4 美拉德中间产物及后期产物[12]的测定

将样品稀释成一定浓度，采用紫外-可见分光光度计分别测定稀释液在294 nm和420 nm波长处吸光度，以A294nm为美拉德反应中间产物及以A420nm为美拉德反应末期产物。

1.3.5 原料、成曲、酱油成品抗氧化活性、总酚含量测定

1.3.5.1 样液的制备

原料/成曲55 ℃烘箱烘12 h，研磨粉碎，过60 目筛。称取粉碎原料/成曲4 g，以料液按质量比1∶20加80%甲醇溶液80 mL，60 ℃、140 r/min气浴振荡提取2 h。抽滤，定容至100 mL，过0.45 mm有机膜，得滤液。

1.3.5.2 DPPH自由基清除能力测定

将滤液/酱油稀释到一定浓度，参考李莹等[13]的方法测定。取2.0 mL样品稀释液，加入2.0 mL 0.2 mmol/L的DPPH-乙醇溶液，摇匀，暗处放置30 min，在517 nm波长处测定吸光度A样品。以蒸馏水加乙醇调零，样品稀释液加乙醇为对照，并测定2.0 mL DPPH溶液与2.0 mL蒸馏水在517 nm处吸光度A空白。

1.3.5.3 2,2’-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS）自由基清除能力测定

将滤液/酱油稀释到一定浓度，参考李莹等[13]的方法有所改进。取40 μL Trolox或样品稀释液，加入4.0 mL ABTS自由基测定液，避光振荡30 s，测定避光反应30 min后734 nm波长处吸光度。ABTS自由基清除能力以Trolox当量物质计，即TEAC值，单位为mmol/mL。

1.3.5.4 还原力测定

将滤液/酱油稀释到一定浓度，参考李丹等[14]的方法。取2.0 mL样品稀释液，加入2.5 mL pH 6.6磷酸盐缓冲液及2.5 mL 1%铁氰化钾溶液，50 ℃保温20 min，再加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液混匀，静置后取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸馏水及0.5 mL 0.1%三氯化铁溶液，静置10 min后于700 nm波长测吸光度A700nm。

1.3.5.5 氧自由基吸收能力测定

将滤液/酱油稀释到一定浓度，根据曹亚兰等[15]的方法有所改进。96 孔板每孔加入20 μL样品稀释液，每个做3 个复孔，孔外围加入pH 7.40的磷酸缓冲液，放入酶标仪中37 ℃孵育10 min，然后每孔加入200 μL荧光素钠溶液，振荡混合10 s，37 ℃孵育20 min。孵育完每孔加入20 μL AAPH溶液，振荡混合10 s。荧光值每4.5 min测定一次，测35 次。将样品作用时荧光衰减曲线下面积分面积与无样品的空白曲线下面积分面积作差，得出样品作为抗氧化剂的保护面积（AUC）。对比样品荧光衰退曲线AUC与标准抗氧化剂Trolox的AUC，计算样品的氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）。

1.3.5.6 总酚的测定

将滤液/酱油稀释到一定浓度，测定方法同1.3.3.1节。

1.4 统计分析

用Origin 9.0软件对数据进行处理和图表的绘制，数据表示为。用SPSS 19.0软件进行单因素ANOVA方差分析及相关性分析，P＜0.05，差异显著。

2 结果与分析

2.1 原料及不同搭配比样品中蛋白质、淀粉含量分析

表2 各酱油样原料中蛋白质、淀粉含量（n=3）Table 2 Contents of protein and starch in raw samples (n= 3)

由表1可知，黄豆蛋白质含量最高，麦胚次之，面粉含蛋白最少。与之不同的是，面粉含淀粉最多，麦胚次之，黄豆最少。酱油主要采用蛋白原料、淀粉原料等经微生物发酵以及酶促和非酶促化学反应而成。因此，黄豆通常充当制作酱油的蛋白原料，面粉主要作为淀粉原料。与黄豆、面粉相比，麦胚蛋白质及淀粉含量居中（表1），其可充当蛋白辅料或淀粉辅料。酿造酱油原料配比，目前尚无统一的配方，南方高盐稀态酱油多采用大豆（豆粕）∶小麦（面粉）为7∶3或8∶2[16]。由表2可知，随麦胚添加量逐渐增多，原料中蛋白质含量上升，淀粉含量逐渐减少，麦胚起到充当蛋白辅料的作用。

2.2 酱油成曲中性蛋白酶、糖化酶活力

表3 各样品成曲蛋白酶、糖化酶活力（n=3）Table 3 Protease activity and amylase activity of koji (n= 3)

由表3可知，相同制曲条件下，中性蛋白酶活力强弱顺序为：成曲S4＞成曲S3＞成曲S2＞成曲S1。依据表2中样品蛋白质含量S4＞S3＞S2＞S1，说明外界条件相同时，原料蛋白质含量越多，提供的底物氮源越多，越有利于米曲霉的生长，因此成曲S4中性蛋白酶活力相对较高。而糖化酶活力强弱顺序为：成曲S2＞成曲S1＞成曲S3＞成曲S4。一般来说，在一定范围内，提供的碳源越多，米曲霉的生长越旺盛，分泌的淀粉酶也就更多[17]。由表2可知，成曲S1的原料提供淀粉含量最多，但成曲S2糖化酶活力比成曲S1高，可能是因为麦胚质地疏松，更利于米曲霉的生长和产酶。若继续增加麦胚添加量，即黄豆、面粉、麦胚搭配比为7∶1∶2（S3）或7∶0∶3（S4）时，由于淀粉含量大大降低，成曲糖化酶活力下降。因此比起单纯使用面粉制曲，适当添加麦胚有利于提高糖化酶活力。

2.3 发酵过程中麦胚酱油各基本理化指标的变化

图1 发酵过程中酱油总氮（A）、氨基态氮（B）、还原糖（C）及总酸（D）的变化Fig. 1 Changes in total nitrogen (A), amino nitrogen (B), reducing sugar (C) and total acid (D) in soy sauce during fermentation

酱油发酵过程中伴随着复杂的生化反应，各指标的变化最终影响酱油的品质。由图1可知，酱油的氨基态氮与总氮的变化规律基本一致，发酵前期（0～30 d）迅速上升，发酵中后期缓慢增加趋于稳定。整个发酵过程中，S2、S3、S4的氨基态氮和总氮均高过S1，说明使用麦胚能够提升酱油氨基态氮及总氮。发酵60 d后，氨基态氮和总氮随麦与胚添加量的增大而上升，说明原料提供蛋白质越多，蛋白酶活相对越高，最终酱油含可溶性含氮化合物越多。

酱油的还原糖呈先迅速增加后下降的趋势，S1、S2、S3、S4分别在发酵第15天时达到6.40、6.95、5.95、5.20 g/100 mL，这与样品对应的糖化酶活高低一致，说明酶活高则还原糖生成量多。随发酵时间延长还原糖下降，这是因为部分糖类物质在发酵过程中经微生物作用转化为醇酸类或参与美拉德反应形成类黑精[18]，还原糖的消耗速度快过生成速度则还原糖量下降。

总酸含量先迅速增加（0～30 d）、后缓慢上升（30～90 d）、又逐步下降（90 d），这是因为随发酵进行，部分还原糖经微生物代谢逐渐转化为有机酸，且伴随美拉德反应缓慢进行，pH值下降，总酸上升[18]，到发酵后期各种有机酸类物质缓慢转化为醇醛类物质的速度超过酸的积累速度，则总酸含量下降。整体来看，整个发酵过程中，S2、S3、S4的总酸均比S1高，说明使用麦胚会对酱油的滋味和风味产生比较大影响。发酵结束S4总酸含量最多，推测是因为酸转化为醇醛的效率低或其米曲霉代谢积累过多酸类物质而造成。

2.4 总酚、总黄酮含量变化

图2 发酵过程中酱油总酚（A）与总黄酮（B）含量的变化Fig. 2 Changes in total phenolics (A) and total fl avonoids (B) content in soy sauce during fermentation

天然多酚类化合物主要包括酚酸、黄酮和单宁类物质等[19]。如图2所示，酱油总酚随发酵时间的延长呈现持续上升的趋势，其中S2总酚含量显著高于另外3 种酱油（P＜0.05），主要是因为S2糖化酶活力＞S1糖化酶活力＞S3糖化酶活力＞S4糖化酶活力，糖化酶活高有利于原料中多酚类物质的释放[20]。整个发酵过程中S2、S3、S4总酚均高于S1，应是S2、S3、S4添加的麦胚含酚类物质[2]，通过微生物作用溶进酱油中，说明除酶活影响外，使用麦胚也能够提升酱油总酚含量。另外，酱油中酪氨酸含酚羟基，福林-酚法测得的酱油总酚含量稍有偏高。酱油总黄酮随发酵时间的延长呈不断上升的趋势，总黄酮含量与麦胚添加量具有极显著正相关性（P＜0.01，r＝0.932），麦胚添加量越多则酱油中总黄酮含量越高，这与酱油中总氮及氨基态氮的变化趋势有一定相似性，猜测一是因为使用麦胚越多则黄酮物质来源多，另外蛋白酶对原料的分解起主导作用[21]，酶活高则能够使原料中黄酮类物质更好地溶解于酱油中。

2.5 发酵过程中酱油美拉德中间产物、末期产物变化

图3 发酵过程中酱油美拉德中间产物（A）、末期产物（B）的变化Fig. 3 Changes in soy sauce Maillard intermediate products (A) and end products (B) during fermentation

美拉德反应能赋予酱油独特的风味和色泽，大量的类黑精等美拉德产物是酱油抗氧化的重要成分[22]。分别以294 nm和420 nm波长处吸光度表征美拉德反应中间产物和后期产物的生成量，探究酱油美拉德产物变化规律。A294nm和A420nm随发酵时间的变化趋势如图3所示，294 nm和420 nm波长处吸光度随发酵时间延长明显上升，说明美拉德中间产物不断形成，并且进一步生成美拉德末期阶段产物，此结果与泰式[20]和日式[23]酱油、高盐稀态酱油[24]美拉德反应产物生成、变化结果基本一致。由图1、3可知，伴随着氨基酸态氮、还原糖的降低，美拉德反应产物逐步增加，其中S2在294 nm和420 nm波长处吸光度最大。

2.6 发酵过程中酱油抗氧化活性的变化

图4 发酵过程中酱油抗氧化活性的变化Fig. 4 Changes in antioxidant activity of soy sauce during fermentation

如图4所示，采用4 种体外抗氧化评价方法表征酱油抗氧化活性，发现酱油抗氧化活性随发酵时间延长显著上升（P＜0.05），主要是因为原料中酚类、多肽类等活性物质不断溶出，美拉德产物、呋喃酮等活性物质也不断生成[25]。以不同抗氧化评价方法表征同一条件酱油的抗氧化活性，发现存在一定差异，主要是酱油中不同的抗氧化活性物质对不同的抗氧化力评价方法的响应不同[26]。通过对比发现，发酵60 d后添加麦胚的酱油抗氧化能力普遍高于S1，说明使用麦胚能够起到提升酱油抗氧化活性的作用。整个发酵周期中S2抗氧化能力最高，显著高于未使用麦胚的S1（P＜0.05）。

2.7 原料、成曲及成品酱油抗氧化活性的比较

表4 原料、成曲及成品酱油总酚含量的比较（n＝3）Table 4 Comparison of total phenolics content among raw materials,koji and soy sauce (n= 3)

酱油中酚类物质产生来源包括制曲、制醅发酵过程中的各种酶促及非酶促反应间大分子的降解、不同物质生物转化等。由表4可以看出，各样品原料经制曲发酵后，成曲总酚含量提高，这是因为制曲过程中淀粉酶能促进总酚含量的提高[27]；原料、成曲的总酚含量与麦胚使用量及其对应的抗氧化能力顺序一致，即总酚含量随麦胚使用量而增加，抗氧化能力也随之上升。添加麦胚的S2、S3及S4总酚含量显著强过未使用麦胚的S1（P＜0.05）。原料S4、成曲S4总酚含量最多，但发酵制醅后最终S2成品酱油总酚含量最高，说明成品酱油总酚含量与麦胚使用量无相关性，总酚含量还有赖于微生物及酶对酱油原料分解利用率。

表5 原料、成曲及酱油成品DPPH自由基清除率（n＝3）Table 5 DPPH radical scavenging capacity of raw materials, koji and soy sauce (n= 3)

表6 原料、成曲及酱油成品还原力（n＝3）Table 6 Fe3+ reducing power of raw materials, koji and soy sauce (n= 3)

表7 原料、成曲及酱油成品TEAC值（n＝3）Table 7 ABTS radical scavenging capacity of raw materials, koji and soy sauce (n= 3)

表8 原料、成曲及酱油成品ORAC值（n＝3）Table 8 Oxygen radical absorbance capacity of raw materials, koji and soy sauce (n= 3)

由表5～8可知，原料和成曲清除DPPH自由基、TEAC值、还原力及ORAC值大小为：S4＞S3＞S2＞S1，说明当黄豆含量相同时，使用麦胚能够提高原料及成曲的抗氧化活性，且随使用量增大而上升，这是因为麦胚含不饱和脂肪酸、谷胱甘肽、麦胚凝集素、黄酮类物质等活性物质[2]，从而成为原料及成曲的抗氧化活性物质的重要来源。原料经发酵变为成曲后，抗氧化能力明显增加（P＜0.05），说明在制曲过程中有新的抗氧化物质产生，如大豆原料中的异黄酮由糖苷型转化为抗氧化活性更高的苷元型[17]。由表5～8可以看出，酱油清除DPPH自由基、TEAC值和ORAC值大小为S2＞S3＞S4＞S1，还原力大小为S2＞S4＞S3＞S1，即4 种酱油中S2抗氧化能力最强，酱油抗氧化活性与原料、成曲抗氧化活性并无相关性，这是因为酱油抗氧化活性物质不仅包括原料、成曲具有的酚酸类、异黄酮类天然抗氧化成分外，还包括经制醅发酵期产生的类黑精、呋喃酮类物质[28]等抗氧化物质。另外，使用麦胚制备的酱油抗氧化能力显著强于传统黄豆酱油S1（P＜0.05），但与麦胚使用量相关性不大（r＝0.009、0.160、0.573、0.091），因此需控制麦胚添加量有效提高酱油的抗氧化活性。

2.8 麦胚添加量、成品酱油活性物质及抗氧化活性之间的相关性分析

表9 麦胚添加量、成品酱油活性物质及抗氧化活性之间的相关性Table 9 Correlations between wheat germ addition and bioactive components and antioxidant activities of soy sauce

酱油抗氧化活性物质主要来源于原料中含有的天然抗氧化成分（酚酸类、黄酮类等）及经发酵、灭菌等工艺产生的抗氧化物质（美拉德产物类黑精、呋喃酮等）[28]，因此选取总酚、总黄酮及美拉德产物作为酱油抗氧化活性成分进行分析。对麦胚添加量、成品酱油活性物质、抗氧化活性进行相关性分析，结果如表9所示，麦胚添加量与酱油总黄酮含量呈极显著性正相关（P＜0.01，r＝0.932），与总酚、还原力呈一般相关性（r＝0.458、0.573），与其他活性物质、DPPH自由基清除率、TEAC值及ORAC值等并无相关性；总酚含量与美拉德产物、总酚含量与抗氧化活性、美拉德产物与抗氧化活性均呈极显著性正相关（P＜0.01，r＞0.8），因此可推断总酚及美拉德产物是赋予酱油抗氧化能力的重要因素，这也与李莹[13]、李丹[14]等研究结果相似。总黄酮含量与清除DPPH自由基、还原力、TEAC值、ORAC值相关系数分别为0.292、0.446、0.703、0.397，表明总黄酮与抗氧化活性之间相关性不高，故无法通过总黄酮含量高直接评价酱油抗氧化活性高。

3 结 论

以麦胚为辅料制备高盐稀态酱油，研究麦胚添加量对酱油理化特性的影响，并筛选出麦胚酱油抗氧化能力的影响因素。通过麦胚部分替代面粉，不仅可显著提高酱油成曲中性蛋白酶活，还能提高成品酱油总氮、氨基态氮的含量。麦胚用量与酱油总氮、氨基态氮存在显著的剂量相关性，最高用量组S4的总氮、氨基态氮较对照组S1分别提高了9.06%、11.48%。此外，添加麦胚还能不同程度地提高酱油总酚、总黄酮及美拉德产物含量。

经4 种体外抗氧化评价方法证实，原料经制曲后抗氧化活性上升，酱油抗氧化活性随发酵时间延长不断上升，且原料、成曲的总酚含量与麦胚添加量及其对应的抗氧化能力顺序一致，但酱油抗氧化活性与原料、成曲抗氧化能力无一致性。

相关性分析结果进一步表明，总酚、美拉德产物与抗氧化能力具有极显著性正相关（P＜0.01，r＞0.8），可作为麦胚酱油抗氧化能力物质的主要影响因素。S2含总酚、美拉德产物最多，其对应的酱油抗氧化能力最强，故黄豆、面粉、麦胚比例为7∶1∶2（S2）是酿造高抗氧化性酱油的适合配比。