云南剑川海门口遗址饱水古木降解的微观构造分析

高景然，邱 坚，邱冬妮，金润授

(1． 西南林业大学，云南昆明 650224； 2． 高丽大学，韩国首尔 530-839； 3． 全南国立大学，韩国光州 500-757)

0 引 言

海门口遗址是目前发现的中国境内最大的“水滨木构干栏式建筑聚落遗址”，在世界上也极为罕见，为研究中国史前聚落类型提供了宝贵实例。遗址所反映的历史信息涉及了农、林、牧、副、渔及上层建筑领域的诸多方面，对研究云南社会发展史及民族史具有十分重要的意义。遗址被评为“2008年全国考古十大发现”之一。

在遗址已发掘的探方中发现了大量的木桩柱，共清理出4 000多根，95%以上材种为云南松(Pinusyunnanensis)。目前相关学者[1]认为大部分木桩柱为房子的基础：柱身上大多有人工加工的痕迹；木桩柱的长度从几十厘米到2 m多不等；直径约5～40 cm。由于发掘遗址滨临海尾河，因此古木呈饱水状态，降解十分严重，甚至少部分古木已发生断裂。

遗址总面积超过50 000 m2，其中有木桩分布的面积约20 000～25 000 m2，已发掘面积1 395 m2[2]，遗址中还有大量的古木未被发掘。对海门口遗址饱水古木降解程度及机理的分析，可为后续的加固保护提供科学有效的理论基础和参考数据。

1 试验材料和与方法

1．1 饱水古木及现代健康材

用于本试验的饱水古木采自海门口遗址探坑AT2001，中间直径12．7 cm，长度62 cm，质量7．9 kg，树种为云南松。腐朽程度中等。对海门口遗址饱水古木具有代表性。

作为对比样的云南松现代健康材采自云南省普洱市。树高1．3 m处胸径18 cm。

1．2 透射电镜(TEM)微观构造试验步骤

1．2．1试剂配制

1) 缓冲液配制。先用超纯水配制质量分数为4%二甲胂酸钠溶液200 mL；再用超纯水配制0.1 mol/L盐酸溶液400 mL；最后用上述两种溶液配制缓冲液，即质量分数4%的二甲胂酸钠溶液200 mL+0．1 mol/L盐酸溶液33．6 mL。溶液配好后置于4 ℃冰箱冷藏。

2) 固定液配制。固定液的配比为:体积分数50%戊二醛溶液∶缓冲液=8∶92。溶液配好后置于4 ℃冰箱冷藏。

3) 质量分数2%锇酸溶液配制。将0．5 g四氧化锇加入24．5 g超纯水中，放置于磁力搅拌器上，加速溶解。

4) 乙醇溶液配制。用超纯水分别配制体积分数为25%、50%、75%、95%的乙醇溶液。

5) 混合树脂配制。为了防止混合树脂过于黏稠，要现用现配。体积比：ERL4206∶DER736∶NSA∶S-1=10∶6∶26∶0．4。其中：ERL4206中文名称为3-环氧乙烷基7-氧杂二环[4．1．0]庚烷的均聚物；DER736中文名称为聚乙二醇环氧树脂；NSA中文名为壬烯基琥珀酸酐；S-1中文名为二甲氨基乙醇。

1．2．2取样 从饱水古木髓心至圆盘边部平均取样，分别标识ST1、ST2、ST3、ST4、ST5。试样长度1 cm(沿木材顺纹方向)，端面边长1 mm。将试样放入上述固定液中。

1．2．3试样固定和脱水

1) 用上述缓冲液清洗试样3次，每次20 min。期间要将试样置于4 ℃冰箱冷藏。

2) 用上述质量分数2%锇酸溶液在室温下浸泡试样2 h。

3) 再用上述缓冲液清洗试样3次，每次20 min。期间要将试样置于4 ℃冰箱冷藏。

4) 乙醇溶液梯度脱水。分别用体积分数25%、50%、75%、95%乙醇溶液对试样逐级梯度脱水，每个级别30 min。最后将试样置于100%乙醇中过夜。

1．2．4试样包埋

1) 将试样置于乙醇丙酮溶液(乙醇∶丙酮=1∶1)中浸泡30 min。

2) 将试样置于丙酮中浸泡30 min。

3) 将试样浸泡于混合树脂丙酮溶液(混合树脂∶丙酮(体积比)=1∶3)中4 h，置于振荡器上。震荡频率为100次/min。

4) 将试样浸泡于混合树脂丙酮溶液(混合树脂∶丙酮(体积比)=1∶1)中4 h，然后置于振荡器上。

5) 将试样浸泡于纯混合树脂中，并置于振荡器上过夜。

6) 将试样放入专用模具中用混合树脂包埋，在70 ℃烘箱中过夜固化。将固化的树脂块编号、封存、备用。

1．2．5切片、染色及观察 用配有钻石刀的超薄切片机切片。将超薄切片用饱和醋酸铅溶液染色着色10～20 min。用透射电镜进行观察。

1．2．6试验设备 日本电子株式会社(JEOL)生产的透射电子显微镜，型号JEM-1011。

1．3 扫描电镜(SEM)微观构造试验步骤

1．3．1冷冻干燥法试样制备

1) 取样。从古木外部到内部平均取样，分别标识SS1、SS2、SS3、SS4、SS5。试样规格5 mm×5 mm×5 mm。

2) 试样固定。参照透射电镜试样固定。

3) 乙醇梯度脱水。分别用25%、50%、75%、95%乙醇溶液对试样逐级梯度脱水，每个级别30 min。

4) 叔丁醇置换乙醇。将试样在乙醇叔丁醇溶液(95%乙醇∶叔丁醇(体积比)=1∶1)中浸泡1 h。然后将试样置于100%叔丁醇中浸泡3次，每次1 h。

5) 将2 mL叔丁醇和古木试样一起放入冷冻干燥器的托盘内，再将托盘放入冷冻室开始冷冻干燥。干燥完成后将试样按编号放在小玻璃瓶内备用。

1．3．2试验设备 日本日立公司生产扫描电子显微镜，型号S-3000N；日本日立公司生产冷冻干燥机，型号ES-2030。

1．3．3测量步骤 将干燥好的试样分三切面固定在样品托盘上，对试样进行表面喷金处理，最后用扫描电镜对样品进行观察。加速电压为15．0 kV。

2 试验结果与讨论

2．1 扫描电镜(SEM)微观构造分析

固定试样并真空冷冻的干燥方法，可以最大限度地保留古木内部的微生物，更有利于古木降解机理的分析。从饱水古木冷冻干燥试样的SEM观察可以发现，古木同时存在真菌降解和细菌降解。

通过试样SS1到SS5的观察发现，在SEM下古木内外微观构造及腐朽程度差异不大。

2．1．1古木的细菌降解 大气环境下的木材通常只受真菌降解。只有在接近无氧的环境下，木材才会遭受细菌降解。海门口遗址饱水古木常年淹埋地下，从其SEM图(图1)中可见明显的细菌腐朽痕迹。

图1c为贮存在古木中的细菌菌群。从图中可以看出这类细菌呈球体颗粒状，从外观不能确定其菌种。事实上，饱水古木内的细菌菌种十分丰富，仅根据外观确定其菌种是很困难的，需通过分子生物技术等方法识别鉴定[3]。Landy等[4]利用DNA技术对26个遗址的饱水古木细菌种类进行了鉴定，发现这些侵蚀细菌主要来自于噬细胞菌属和黄杆菌属以及一些未知菌种。这类细菌主要降解纤维素和半纤维素，也可以降解少量木质素。木材次生壁的多糖类物质含量相对较多，而胞间层木质素含量相对较多。从图1a可以看出古木胞间层保存相对完好，而次生壁降解相对严重，冷冻干燥后仍能使其产生严重收缩。这说明海门口遗址饱水古木纤维素和半纤维素降解相对严重，而木质素降解相对较少，因此可以推测海门口遗址饱水古木中细菌种类也在上述Landy等鉴定的菌种范围之内。

图1b为放大4 000倍的晚材细胞端面。细胞次生壁已经收缩并与胞间层脱离，但次生壁上的空隙仍很明显，这些空隙是细菌啃噬的典型特征。细胞腔内填满了细菌代谢物。

图1d为从早材纵切面观察古木内壁降解情况。可以明显看出古木细胞壁S3层已经遭到破坏，内壁表层出现裂隙或小孔，细胞壁呈松散状。这些都是典型的细菌腐朽特征[5]。从整体来看，古木内部这种形式的降解非常普遍。这说明海门口遗址饱水古木主要是受细菌降解。从图1d还可以看出，由于试样采用真空冷冻干燥，干燥应力相对较小，纹孔膜虽遭到一定程度破坏，但未脱落，部分与纹孔相连。

2．1．2古木的真菌降解 前人通过研究发现，饱水古木中发现的真菌绝大多数属于软腐真菌。由于古木树种以及淹埋环境等因素的不同导致菌种存在差异，因此不同饱水古木的软腐形式也各不相同。前人在饱水古木中发现的软腐真菌目前已达444种[6-7]。通常这类真菌穿透能力差，其穿透多数仅发生在木材表面，使木材变色，但降解严重时也会使木材变软。腐真菌都属于微型真菌，其子实体在肉眼下不可见[8-10]。

图1a箭头所指为贮存在射线薄壁组织中的真菌菌丝。试样中贮存在射线薄壁细胞中的真菌菌丝通常聚集成群。由于射线薄壁细胞含有相对丰富的抽提物及淀粉等物质，因此这类真菌主要降解淀粉、抽提物等物质。另外在射线薄壁细胞内壁并未发现真菌侵蚀的坑道，故推测这类真菌对纤维素等细胞壁物质的降解较少。从图1a还可看出胞间层保存较完好，呈连续网状，这是古木在饱水状态下能够保持原来形状的主要原因。

图1f两个箭头所指为贮存在古木管胞中的真菌菌丝。古木管胞中的真菌通常单个出现，且主要通过纹孔侵入管胞内部，如图1e所示。这说明此类真菌对多糖类及木质素的降解能力差，不易穿通细胞壁。

海门口遗址饱水古木中的真菌菌丝主要出现在试样SS1、SS2中，也就是说这类真菌菌丝主要出现在古木外部。图2为用于真空冷冻干燥法制备SEM试样的木块。该木块材质疏松，用手轻轻按压即有明显压痕。其内部(浅色部分)和外部(深色部分)材质的疏松程度在感官上差异不大，主要是颜色上存在差异。真菌菌丝主要出现在外部深色部分。这说明古木中的真菌主要使木材变色，而对细胞壁实质物质降解很少，故应属软腐真菌。

2．2 透射电镜(TEM)微观构造分析

图3a为云南松现代健康材管胞在TEM下放大10000倍微观构造。图中管胞壁结构完整，表面平滑。S3层及胞间层颜色偏深。

图3b标识“D”的区域为古木细胞壁降解(degradation)区域，标识“UD”的区域为未降解区域。降解区域颜色偏浅，呈浅灰色；未降解区域颜色偏深。从该图可以看出，相邻的三个细胞，有的发生了降解，而有的则保存完好。发生降解的两段细胞壁降解程度也不相同。甚至在同一细胞内，部分细胞壁降解，部分细胞壁未降解。从降解痕迹看，主要为细菌降解。但不能排除木材细胞壁化学成分发生水解或光解的可能性。因此，海门口遗址饱水古木主要以细菌为主，同时在一定程度上也受到其它因素的影响。从图3b还可以看出胞间层保存完好。即使是在图3e和图3f降解较严重的细胞中，胞间层仍保存完好。由于细胞壁胞间层木质素含量最高，说明细菌对木质素的降解能力有限，使得古木胞间层得以保存。

除了胞间层外，通常细胞壁S3层是木质素含量相对较高的部位。从图3e和图3f可以看出，二者细胞壁S2层降解都很严重。不同之处在于图3e中左上角细胞S3层未降解，保存基本完好，而图3f中右上角和左下角细胞壁S3层已不存在，右下角细胞壁S3层部分发生降解。图3f中箭头所指为典型的细菌空穴腐朽模式[11]，即细菌在细胞腔内壁首先分解S3层，然后侵入S2层。

图3d更加清楚地展示了相邻的细胞有的被严重腐朽，有的保存完好。图中浅色部分为发生降解的细胞壁，深色部分是未降解的细胞壁。图中箭头所指为已降解细胞和未降解细胞之间的纹孔。纹孔中的纹孔膜保存完好。由于纹孔膜木质素含量相对较高，因此能够在一定程度上阻止细菌在相邻细胞间通过纹孔移动。但从前述SEM微观图中可知，古木纹孔被部分破坏。这为细菌通过纹孔侵入细胞壁内部或相邻细胞提供了更加便利的条件。

图3c中箭头所指为侵入细胞壁S2层的细菌。它可能是从纹孔侵入，也可能是从S3层侵入。通过图3c右下角白色标尺衡量可以大致估算，饱水状态下古木细胞壁内的孔隙尺寸大概在几十甚至几百纳米之间。这些大尺寸空隙可以容纳自由水。因此，海门口遗址饱水古木在干燥后重新吸水，木材虽然会湿胀，但恢复不到原来的尺寸[12]。现代健康材在湿润状态下细胞壁内孔隙约1～10 nm[13]。对于现代健康材，木材干燥后重新吸水，细胞壁内的羟基会重新与水分子结合，使木材再恢复到原来的体积[14]。

3 结 论

通过SEM观察可知，海门口遗址饱水古木细胞次生壁由于严重降解而发生收缩，并与胞间层分离。胞间层保存相对较好，呈连续网状，这是古木在饱水状态下能保持原来形状的主要原因。古木内细菌菌群及其代谢物较多，细胞壁上可见典型的细菌腐朽特征，说明饱水古木主要受到细菌降解。古木内同时也可见真菌菌丝，但这类真菌主要降解蛋白质等物质，对纤维素等细胞壁物质降解能力较差，其属于软腐真菌，主要使古木变色。

通过TEM观察可知，古木内细胞降解程度不同，即使是同一细胞内，也存在部分降解但部分未降解的情况。细菌主要通过S3层侵入细胞壁内部，并进一步降解细胞壁S2层，但胞间层保存相对完好。细胞壁内由于降解而产生的空隙大概在几十到几百纳米之间。