温敏型淀粉酶产生菌的分离、分子生物学鉴定及特性研究

闫 丽

(首都博物馆文物保护修复中心生物实验室，北京 100045)

董 振，刘伟杰

(江苏师范大学生命科学学院，江苏徐州 221116)

0 引 言

淀粉酶是一种生物催化剂，可以用于人造棉、高质丝绸、化学纤维退浆等纺织品工业[1]；在洗涤剂工业中，用于制成多酶洗衣粉等，具有非常广泛的用途。此外，作为一种生物酶，淀粉酶具有催化效率高，活性好和底物专一性的优点。

我国有大量珍贵的书画文物，在修复过程中选择的保护方法一定要尽量减少对书画文物的损伤，延长书画文物的寿命[2-3]。近年来，淀粉酶开始应用于古代文物书画的修复中。揭展是书画重新装裱过程中最重要的一环。在装裱过程中所用的浆糊往往与画心、命纸很难分离，导致揭展过程复杂，且容易造成古书画的损毁。传统的揭取方法是用水长时间闷润书画以降低浆糊的黏性，然后用手指轻轻地捻搓命纸，使旧命纸和浆糊从画心背面剥离，此方法对于难揭展的纸质画心极易揭晃。而利用淀粉酶制备生物揭展剂，作用于模拟材料(两张宣纸用浆糊粘结起来，然后老化)[4-6]，利用酶的高效催化功能，将浆糊等胶黏剂的大分子分解，而且由于酶的催化选择作用[7]，不产生对文物的破坏作用。前期研究工作利用淀粉酶已可以高效地揭展古书画，并取得了良好的揭展效果[5]。然而该技术还存在技术难点，揭展后残留的淀粉酶会影响二次装裱，因此迫切需要开发一种温度敏感性淀粉酶，在揭展完成后，利用微热温度使残留的淀粉酶失活，避免淀粉酶对再次装裱的影响。

本研究从土壤中分离获得一株产温度敏感型淀粉酶的菌株，对菌株进行了分子生物学鉴定，确定了其种属分类地位，并分析了所产生淀粉酶的酶活特性，为古代字画文物的低损伤修复提供了良好的温度敏感型淀粉酶资源。

1 材料和方法

1．1 材料与试剂

为了筛选产温度敏感型淀粉酶的菌株，从东北寒地土壤中采集样品，用于菌株分离。实验过程中所用的酸水解酪蛋白购自上海蓝季科技发展有限公司，碘化钾购自连云港贝尔化学试剂有限公司，柠檬酸三钠购自无锡市亚盛化工有限公司，其他所用药品购自国药集团化学试剂有限公司。

1．2 培养基

筛选确定培养基：1)可溶性淀粉6 g/L，胰蛋白胨2 g/L，酸水解酪蛋白2 g/L，K2HPO41.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，酵母粉2 g/L，琼脂粉20 g/L。2)LB培养基：NaCl 10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，琼脂粉20 g/L(制备固体平板时加入)。以上培养基均115 ℃灭菌30 min。

1．3 菌株筛选[8-9]

将少许取自东北寒地的土壤样品放入EP管中，加入灭过菌的生理盐水，然后混匀并进行梯度稀释，稀释成浓度分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的稀释液；将浓度为10-3、10-4、10-5的稀释液用涂布棒涂布在固体分离培养基上；倒置于恒温培养箱(苏州培英实验设备有限公司)，28 ℃培养24 h；将初筛选菌种，通过四区划线的方法进行多次分离纯化，吸取3 mL碘液于分离培养基平板中，染色10 min。倒去染料后，用细流水进行冲洗，直至冲洗下的水透明，观察平板中形成的透明圈，最终得到纯种菌种，用20%的甘油管保种备用。

1．4 菌株鉴定[10]

分析菌株的16S rRNA确定其种属地位。用移液枪(北京大龙兴创实验仪器有限公司)吸取50 μL的菌液置于EP管中，以10 000 r/min的条件，离心5 min，去上清，将50 μL无菌水加入EP管中，将菌悬液在沸水浴煮沸3 min；然后冰水浴2 min，沸水浴和冰浴重复两次；然后10 000 r/min离心，取1 μL上清液作为扩增模板。采用16S rRNA基因的通用引物配成50 μL体系进行PCR反应，PCR仪购于卡优迪生物科技有限公司。上游引物(1492R)：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，下游引物(27F)：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’。PCR扩增条件为95 ℃ 1 min；95 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32个循环；72 ℃ 10 min。然后用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，电泳仪购于北京六一生物科技有限公司。PCR产物送北京博迈德科技发展有限公司测序，结果提交至NCBI数据库进行BLAST比对，并利用MEGA 5软件计算出序列的系统进化距离，采用邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树，确定菌株BWL1025的种属发育地位。

1．5 菌株BWL1025产酶及酶学特性分析

1．5．1淀粉酶活性的测定 采用DNS显色法[11]分析淀粉酶酶活。取1 mL菌液于EP管中，以8 000 r/min的条件，离心5 min，取上清用作粗酶液；在150 μL的1%淀粉溶液中加入50 μL的上清菌液作为实验组；在加入150 μL的1%淀粉溶液中加入50 μL沸水浴30 min后的上清菌液作为对照组；将实验组和对照组放入水浴中保温30 min；加入150 μL的DNS和100 μL的NaOH溶液，沸水浴5 min；定容至1 mL，用空白组调零后，测OD540的值，并取平均值。以50 μL的去离子水替代反应体系中的酶液的体系作为空白对照组用于OD540调零。淀粉酶酶活的表示：在特定条件下，1 min内将淀粉底物转化为1微摩尔葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位。

1．5．2pH对酶活性的影响 将淀粉底物分别溶解在pH为4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0的缓冲液中，与粗酶液混合后，37 ℃水浴中反应30 min，测定淀粉酶活性，确定最佳反应pH。将粗酶液置于pH 4.0～11.0的缓冲液中处理30 min，然后在最佳pH和37 ℃的条件下反应30 min，确定淀粉酶酶活的稳定性。

1．5．3温度对酶活性的影响 将粗酶液、淀粉底物混合后，分别置于25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80 ℃水浴中反应30 min，测定淀粉酶活性，确定最低失活温度。

1．5．4淀粉酶最短失活时间的测定 根据1．5．3的实验结果，将粗酶液、淀粉底物混合后，在最低失活温度下，在不同的处理时间(0、5、10、15、20、25、30 min)测量酶活性，确定淀粉酶的最短失活时间。

1．5．5氮源对酶活性的影响 以葡萄糖为碳源，分别以酵母粉、胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉膏、酸水解酪蛋白、尿素、硝酸铵、硝酸钾作为发酵培养基的氮源，然后按照1%的接种量，以28 ℃、180 rpm的条件培养24 h，通过测淀粉酶的酶活确定最佳氮源。

1．5．6碳源对酶活性的影响 以酵母粉为氮源，分别以羧甲基纤维素钠、木糖、蔗糖、乳糖、淀粉、麦芽糖、果糖、葡萄糖、鼠李糖作为发酵培养基的碳源，按照1%的比例接种菌液，以28 ℃、180 rpm的条件培养24 h，通过测淀粉酶的酶活确定最佳碳源。

2 结果与讨论

2．1 产淀粉酶菌的筛选及形态学分析

如图1所示，菌落呈圆形，湿润，不透明，呈乳白色。如图2所示，经革兰氏染色后，发现菌株BWL1025为革兰氏阳性菌，杆状。如图3所示，将分离培养基平板利用碘液染色后，可以很清楚的看出透明水解圈，说明菌株BWL1025具有较强的淀粉酶酶活。

2．2 菌株鉴定

对菌株BWL1025的16S rRNA序列进行扩增后，测序获得长1 328 bp的目标序列，将目标序列提交至NCBI数据库并进行BLAST比对，并利用MEGA5软件构建系统发育树。结果如图4所示，发现菌株BWL1025与Bacillussubtilis的同源性最高，综合形态学和系统发育分析确定菌株BWL1025属于枯草芽孢杆菌。

2．3 淀粉酶的酶学性质研究

2．3．1pH对酶活性的影响 由于古代文物字画会出现酸化现象，为了更好地指导该淀粉酶在文物修复中的应用，本研究分析了pH对菌株BWL1025产生淀粉酶的活性及稳定性的影响。如图5所示，酶活随着pH值的升高呈先上升后下降的趋势，菌株BWL1025所产生的淀粉酶的最适pH值为6.0，此时酶活最高。在pH 4.5～5.0时，有所下降，但酶活依然能达到最高酶活的60%以上。此外该淀粉酶的酶活稳定性也是随着pH值的升高呈先上升后下降的趋势，在pH6时酶活最稳定，而在pH 4.5～5时，酶活能达到最高酶活的70%以上。

2．3．2温度对酶活性的影响 温度对菌株BWL1025产生的淀粉酶酶活的影响如图6所示，温度对该淀粉酶的酶活影响很大，从25 ℃开始，随着温度的升高酶活升高，在40 ℃时，淀粉酶酶活达到最高0.839 IU/mL，表明该温度为菌株BWL1025产淀粉酶的最适温度；而在60 ℃及以上时，酶活基本消失，表明60 ℃为该淀粉酶的最低失活温度。相比较其他淀粉酶的失活温度来说，60 ℃为较低的失活温度，表明菌株BWL1025可以产生温度敏感型淀粉酶。

2．3．3淀粉酶最短失活时间的测定 由图6所示，60 ℃为菌株BWL1025所产淀粉酶的最低失活温度，因此在温度60 ℃时，分析菌株BWL1025所产淀粉酶的最短失活时间。如图7所示，随着处理时间的延长，淀粉酶酶活力快速降低，并且在处理25 min后，酶活基本消失。由此可知，25 min为该淀粉酶在60 ℃的条件下最短失活时间。在已有报道中，能够产生淀粉酶的芽孢杆菌属菌株较多，但已报道淀粉酶的最适温度多为60 ℃左右，热稳定性较好[12-13]，因此在书画文物的修复中应用受到很大的限制。本研究从我国东北寒地土壤中取样，从中分离温度敏感性的淀粉酶，最适温度为40 ℃，60 ℃加热即可以实现对淀粉酶的失活，有利于解决淀粉酶揭展书画文物后的酶残留问题。

2．3．4氮源对酶活性的影响 氮源能够提供给微生物氮素营养，其作用是供给微生物合成蛋白质和含氮物质的原料。对菌株BWL1025进行了发酵氮源优化，选取了酵母粉、胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉膏、酸水解酪蛋白、尿素、硝酸铵、硝酸钾八种氮源。如图8所示，当以尿素、硝酸铵、硝酸钾为氮源时，菌株BWL1025所产淀粉酶的酶活基本为零；当以蛋白胨和牛肉膏为氮源时，酶活较低；而以酵母粉、胰蛋白胨、酸水解酪蛋白为氮源时，酶活力较高；其中以酵母粉为氮源时，酶活力最高，达到1.306 IU/mL。因此选择酵母粉为菌株BWL1025发酵的最佳氮源。

2．3．5碳源对酶活性的影响 碳源常通过影响微生物的糖代谢、呼吸、能量、生长及相关代谢而影响微生物的次生代谢产物的合成和分泌[14]。因此对菌株BWL1025发酵培养基的碳源进行优化，选择了羧甲基纤维素钠(CMC)、木糖、蔗糖、乳糖、淀粉、麦芽糖、果糖、葡萄糖、鼠李糖九种碳源。如图9所示，当以羧甲基纤维素钠、乳糖、果糖、鼠李糖为碳源时，酶活力较低，不适合作为发酵碳源。而以木糖、蔗糖、淀粉、麦芽糖、葡萄糖为碳源时，酶活力较高；其中以木糖为碳源时，酶活力最高达到1.63 IU/mL。因此本研究选择木糖作为菌株BWL1025的最佳发酵碳源。

图9 碳源对菌株BWL1025所产淀粉酶酶活的影响

3 结 论

我国的博物馆里有许多珍贵的书画文物，在修复过程中，揭裱是一个难题。淀粉酶可以降解淀粉浆糊，提高揭裱效率，但揭裱后残留的淀粉酶会影响后续的再次装裱，因此揭裱后淀粉酶的失活问题亟待解决。本研究针对这个问题，利用碘液染色分离培养基平板的方法，从东北寒地土壤样品中分离获得一株产生温度敏感型淀粉酶的功能菌株BWL1025。经过形态学和分子生物学鉴定发现菌株BWL1025为枯草芽孢杆菌。该菌株在40 ℃时，酶活达到最高值0.839 IU/mL；在60 ℃处理25 min后，酶活基本消失。在对菌株BWL1025的发酵碳氮源进行优化时，发现木糖和酵母粉分别为最佳碳源和氮源，淀粉酶酶活最高达到1.63 IU/mL。本研究发现的菌株BWL1025产生的淀粉酶为温度敏感型淀粉酶，在较低温度下可失活，有效解决残留淀粉酶对书画文物再次装裱的影响，在古代书画文物的修复中具有很好的应用前景。