活血降脂胶囊对高脂血症大鼠血脂和脂肪肝调脂的机制研究

， ， ，小军

心脑血管病是危害人类健康的常见病和多发病，其以高发病率、高复发率、高致残率、高死亡率受到医学界的广泛关注。动脉粥样硬化是导致脑血管疾病的重要原因，而血脂异常是动脉粥样硬化最重要的危险因素之一，积极调节血脂可减轻动脉粥样硬化的程度，最终达到减少心脑血管疾病的发生率、复发率及死亡率的目的，减轻病人的思想及经济负担，提高生活质量。目前很多调脂药物的不良反应限制了它们在临床的应用。活血降脂胶囊为山西省中医院中药复方制剂，应用20年来，临床效果好，不良反应小。本研究观察活血降脂胶囊对血脂水平的影响，为临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 高脂饲料 北京华阜康生物科技股份有限公司提供，主要成分：78.8%基础饲料、1%胆固醇、10%蛋黄粉、10%猪油和0.2%的胆盐，批号：11003800007181，许可证号：SCXK(京)2014-0008。

1.2 主要药物与试剂 活血降脂胶囊，由山西省中医药研究院制剂室提供；辛伐他汀片(杭州默沙东制药有限公司)，规格：20 mg，批准文号：国药准字J20130068；正常兔血清封闭液，武汉博士德生物工程有限公司；山羊IgG，武汉博士德生物工程有限公司；生物素化兔抗山羊IgG，武汉博士德生物工程有限公司；SABC免疫组化染色试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司；DAB显色试剂盒武汉博士德生物工程有限公司；其他试剂包括：粘片剂APES(武汉博士德生物工程有限公司)；30%H2O2；蒸馏水；0.01 mmol/L枸橼酸缓冲液(pH6.0)；免疫组化专用PBS(pH7.2～7.6)；蒸馏水、10%水合氯醛、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)试剂盒：南京建成生物工程研究所提供。

1.3 主要仪器 赛默飞世尔(上海)FINNPIPETTE微量移液器；上海安泰分析仪器有限公司AT-858型自动酶标分析仪；科大创新股份有限公司KDC-2046低速冷冻离心机；北京中兴伟业仪器有限公司DZKW-4恒温水浴箱；石蜡包埋机：Histocentre 3，英国Shandon；石蜡切片机：Finesse 325，英国Shandon；全自动组织脱水机：Excelsior，英国Shandon；荧光显微成像系统：BX53，日本Olympus公司。

1.4 实验动物 SD大鼠雄性雌性共57只，鼠龄40～45 d，体重100 ～120 g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，清洁级，合格证号：11401300033000，许可证号：SCXK(京)2014-0004。

1.5 实验方法

1.5.1 动物饲养 动物购入后在实验室适应性饲养普通饲料1周，不限饮水、饮食。

1.5.2 动物分组及给药方法、剂量 将57只大鼠，随机抽取空白组(A组)12只，给予普通饲料喂养，其余45只饲高脂饲料制备大鼠高脂血症模型，2月后随机抽取空白组10只，模型组10只，禁食不禁水12 h，股动脉取血，测TC、TG、LDL-C、HDL-C，测得模型组TC、TG、LDL-C较空白组高，HDL-C降低或无变化，提示造模成功。

造模成功后，将模型组45只大鼠随机分为3组，高脂模型组(B组)、辛伐他汀片组(C组)、活血降脂胶囊组(D组)。造模成功后，57只大鼠均给予普通饲料喂养，各组均按10 mL/kg体重灌胃，空白组和高脂模型组蒸馏水灌胃，给药组给药，C组0.83 mg/kg、D组1.5 g/kg，连续给药30 d，每7天称体重1次，根据体重调整药量。

1.5.3 观察指标与方法 实验周期结束后，10%水合氯醛按3.5 mL/kg腹腔麻醉，腹主动脉采血，离心机离心，取血清，用血脂四项试剂盒测定TC、TG、LDL-C、HDL-C。取肝脏组织，经制片、脱水、切片、染色、封片等步骤后，在光镜下观察病理改变。另取肝脏组织，免疫组化采用石蜡切片热修复抗原程序。①采用APES载玻片防脱片剂处理；②切片常规脱蜡至水；③30%H2O21份+蒸馏水10份混合，室温10 min灭活内源性酶；④将切片浸入0.01 mmol/L枸橼酸盐缓冲液，微波炉加热沸腾，间隔5 min反复1次，冷却后PBS洗涤2次；⑤滴加封闭液，室温20 min；⑥滴加山羊IgG，4 ℃过夜；⑦加生物素化兔抗山羊IgG，37 ℃20 min，PBS洗2 min×3次；⑧滴加试剂SABC，37 ℃20 min，PBS洗5 min×4次；⑨使用DAB显色试剂盒显色，镜下控制反应时间；⑩苏木素轻度复染，脱水，透明，封片，显微镜观察。

2 结 果

2.1 给药前模型组与各组间血脂指标比较 给药前，与空白组相比，模型组TC、TG、LDL-C均增高，HDL-C下降，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，提示造模成功。详见表1。

2.2 给药后各组间血脂指标比较 给药后，与高脂模型组相比，辛伐他汀片组及活血降脂胶囊组TC、TG、LDL-C均降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，HDL-C增高，但差异无统计学意义(P>0.05)，表明活血降脂胶囊可有效改善大鼠血脂水平。辛伐他汀片组与活血降脂胶囊组相比，血脂水平差异，无统计学意义，提示两组用药调节血脂疗效接近，但活血降脂胶囊血脂水平更低一些，提示活血降脂胶囊可能疗效更好。详见表1。

表1 给药后各组间血脂指标比较(±s) mmol/L

与空白组比较，1)P<0.05，与高脂模型组比较，2)P<0.05

2.3 肝脏病理改变结果 空白组未见异常。高脂模型组多处见肝小静脉周围慢性炎细胞散在浸润；多处灶状肝细胞坏死后炎细胞浸润；全肝细胞脂肪变性。辛伐他汀组少部分肝细胞脂肪变性。活血降脂胶囊组少部分肝细胞脂肪变性。详见图1。

图1肝脏病理图

2.4 肝脏载脂蛋白表达结果 空白组载脂蛋白A表达最强，与空白组相比，模型组载脂蛋白A表达明显减弱，给药组与模型组相比，载脂蛋白A表达均增强，提示活血降脂胶囊能使高脂血症大鼠的载脂蛋白A表达增强。而各组载脂蛋白B表达未见明显不同，提示各组对载脂蛋白B表达改变影响不明显。详见表2、图2、图3。

表2 肝脏载脂蛋白表达表

注：-阴性，+ 浅黄色，++ 黄色，+++棕黄色

图2 肝脏载脂蛋白A表达

图3 肝脏载脂蛋白B表达

3 讨 论

血脂包括TG、TC和类脂，与临床相关的主要血脂成分为TG、TC，血脂需要与载脂蛋白结合形成脂蛋白存在于血液中，人体主要脂蛋白包括HDL-C、LDL-C，LDL-C是含有胆固醇最多的脂蛋白，其中主要载脂蛋白为ApoB100，HDL-C中主要载脂蛋白为Apo A1，高脂血症的形成主要与TC、TG、LDL-C密切相关，其中LDL-C是动脉粥样硬化的主要危险因素，HDL-C可将血清胆固醇转移至肝脏从而起到降血脂的作用。

活血降脂胶囊作为山西省中医院制剂，在多年临床应用中取得较好疗效，可以调节血脂，改善脂肪肝及动脉粥样硬化，活血降脂胶囊主要成分包括：山楂、泽泻、丹参、黄芪、茵陈、决明子、川芎。山楂中具有调脂作用的物质包括总黄酮、三萜酸等，通过多种途径来调节血脂，如：增加低密度脂蛋白受体水平，提高胆固醇7α-羟化酶的表达水平，抑制酰基辅酶A活性，抑制3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶等，具有明确的调脂作用[1]。泽泻能通过升高HDL-C，降低LDL-C达到调节血脂，防治动脉粥样硬化及脂肪肝的作用[2]。丹参能降低TC、LDL-C达到调脂作用[3]。黄芪[4]、茵陈[5]、决明子[6]也具有明确的降脂作用。川芎没有明确的调脂作用，但对血管有明确的保护作用，能够抗炎、抗血小板聚集、改善动脉粥样硬化等[7]。在本实验中，活血降脂胶囊可以降低高脂血症大鼠TG、TC、LDL-C水平，且疗效与辛伐他汀片相比，可能有一定优势，在动物实验中证明活血降脂胶囊调节血脂的有效性。

非酒精性脂肪性肝病病理改变以肝细胞脂肪变性、炎症变化为特征[8]。有研究显示活血降脂胶囊对非酒精性脂肪肝有明确的治疗作用[9]。本实验中高脂模型组全肝脂肪变性，并出现部分肝细胞坏死和多处炎细胞浸润，证明了造模成功，活血降脂胶囊可以有效改善非酒精性脂肪肝的脂肪变性，对脂肪肝有明确的保护作用。

血清载脂蛋白是血清脂蛋白中的蛋白质成分，包括A、B、C、D、E五类，与临床相关的主要是载脂蛋白A和载脂蛋白B。载脂蛋白A可分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅳ型，统称为载脂蛋白A，载脂蛋白A是HDL-C的主要载脂蛋白，体现了HDL-C的功能，与动脉粥样硬化呈负相关关系。载脂蛋白B是LDL-C的主要成分，体现了LDL-C的功能，与动脉粥样硬化成正相关。载脂蛋白主要在肝脏合成，肝脏载脂蛋白的表达可以体现人体脂质代谢的能力。本实验中，高脂模型组肝脏载脂蛋白A表达明显下降，活血降脂胶囊各组均能使载脂蛋白A表达升高，体现了活血降脂胶囊有可能是通过提高肝脏载脂蛋白A表达而达到调节血脂的作用。各组肝脏载脂蛋白B表达未见有意义的不同，尚不能排除无关性，有必要进一步研究。

此实验肯定了活血降脂胶囊的降脂效果，其调脂机制可能为提高肝脏载脂蛋白A的表达，进而影响血清血脂水平，并且能够对脂肪肝有明确的治疗作用，且此药副作用较小。但其具体降脂机制尚不明确，可进一步扩大样本量进行研究，并将大鼠处死选取肝脏组织和主动脉，观察血管内皮生长因子(VEGF)及基质金属蛋白酶-9(MMP-9) 在主动脉的表达情况，进一步探讨中药复方制剂活血降脂胶囊对干预大鼠炎症介质、基质金属蛋白酶、细胞因子及稳定动脉粥样硬化斑块的相关性，探索活血降脂胶囊在稳定动脉粥样硬化斑块的作用机制，为活血降脂胶囊的临床应用提供更为坚实的理论依据。