合欢花饮片标准汤剂质量标准评价的建立△

冯玉，田宇柔，2，3，高乐，2，3，范帅帅，李军山，牛丽颖，2，3*

1.河北中医学院，河北 石家庄 050091；2.河北省中药配方颗粒工程技术研究中心，河北 石家庄 050091；3.河北省高校中药配方颗粒应用技术研发中心，河北 石家庄 050091；4.神威药业集团有限公司，河北 石家庄 051430

合欢花为豆科植物合欢AlbiziajulibrissinDurazz.的干燥花絮或花蕾，味甘，性平。归心、肝经，具有解郁安神的功能，用于心神不安、忧郁失眠[1]。合欢花具有多种化学成分，其主要成分为黄酮类，其次为挥发油类及其他化学成分[2]。黄酮类化合物如槲皮苷是合欢花的主要有效成分，现代研究多以总黄酮和槲皮苷作为合欢花的指标成分[3]。迄今从合欢花中获得的黄酮类化合物包括山柰酚、槲皮素、异鼠李素、木犀草素、槲皮苷、异槲皮苷、芦丁等，其中以槲皮苷含量最高[4]。此外，合欢皮中还含有α-菠甾醇、α-菠甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷、鞣质等。合欢花有一定的食疗作用，对肥胖、抑郁症、失眠有较好疗效，并具有清除自由基的作用，合欢花提取物对一般常见的海洋致病菌有较好的抑菌作用，水煎液能起到镇静催眠的作用[5-6]。

中药是中华民族的瑰宝，我们应该深入研究、大力宣传中医药文化[7]。中药配方颗粒是在中医药理论指导下把单位药饮片经现代科学提取、浓缩、干燥制粒，其作为一种新型的中药饮片改进剂型，保留了中医随症加减的辨证论治，又为不方便煎煮的患者提供了方便，并且质量可控，具有安全、起效快、易吸收、使用方便等的优点[8]。国家食品药品监督管理总局为了规范配方颗粒的管理，起草了《中药配方颗粒管理办法》，国家药典委员会随后发布了《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(征求意见稿)》，并提出标准汤剂的一词，规定了中药配方颗粒的所有药学研究均应与标准汤剂进行比对，保证两者质量一致性[9]。工艺参数的确定，为中药标准化提供了基础，有利于促进用药质量提高，保证用药的准确性和剂量的一致性[10]。本实验对合欢花中含量最高的物质槲皮苷进行含量测定，并进行了指纹图谱的研究，旨在为合欢花标准汤剂的质量控制研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器

超高效液相色谱仪UPLC(waters)；岛津高效液相色谱仪。

1.2 试药

槲皮苷(中国食品药品检定研究院，批号：111538-201105)；合欢花对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：121010-201504)；乙腈、甲醇(Fisher，色谱纯)；水(超纯水)；其他试剂均为分析纯。

15批合欢花饮片经神威药业集团有限公司质量检测中心鉴定符合2015版《中华人民共和国药典》“合欢花”项下规定。产地及批号见表1。

表1 合欢花饮片来源

2 方法与结果

2.1 标准汤剂的制备

称取合欢花饮片100 g，煎煮两次，第一煎加12倍水，第二煎加10倍水，第一次煎煮前浸泡30 min，武火煮沸，文火保持微沸30 min；二煎文火保持微沸20 min，用200目筛网趁热分离，合并煎液，冷却，60 ℃真空减压浓缩并测定流浸膏的密度、pH值，制备标准汤剂干燥粉末，计算出膏率。

表2 合欢花标准汤剂测定

2.2 槲皮苷含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：岛津wondasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈-0.1%磷酸(23∶77)为流动相；流速：1.0 mL·min-1；检测波长为256 nm。色谱图见图1。

注：A.槲皮苷对照品；B.合欢花标准煎液。图1 槲皮苷对照品及合欢花标准煎液HPLC图

2.2.2 供试品溶液的制备 取2.1项下所得干膏粉约0.1 g，精密称定置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，称重，超声处理10 min，称重，用稀乙醇补重，滤过，即得。

2.2.3 对照品溶液的制备 精密称取槲皮苷对照品适量，用甲醇溶解得质量浓度为0.087 5 mg·mL-1的对照品溶液。

2.2.4 方法学考察

2.2.4.1 线性关系考察 分别精密吸取2.2.3项下槲皮苷对照品溶液2、4、6、8、10、12、14 μL，按2.2.1项下色谱条件测定峰面积，以进样量(μg)对峰面积进行线性回归，得回归方程：Y=2.929 8×106X-5.263 1×104，r=0.999 4，表明槲皮苷在0.175 0～1.225 0 μg线性关系良好。

2.2.4.2 精密度试验 取槲皮苷对照品溶液，连续进样6次，测定槲皮苷的峰面积，结果RSD为0.65%(n=6)，说明仪器精密度良好。

2.2.4.3 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液5 μL，依照2.2.1项下色谱条件分别在0、2、8、12、14、18、22 h测定槲皮苷峰面积，计算峰面积RSD为0.62%(n=6)，说明槲皮苷在22 h内基本稳定。

2.2.4.4 重复性试验 称取同一批干膏粉6份，每份0.1 g，按样品测定方法进行测定，计算得供试品溶液中槲皮苷含量RSD为1.03%(n=6)，表明方法重复性良好。

2.2.4.5 准确度试验 称取同一批干膏粉6份，每份约0.05 g，精密加入一定体积的槲皮苷对照品溶液，以本法测定槲皮苷含量并计算回收率，结果平均回收率为102.19%(n=9)。

2.3 样品测定

采用确定的色谱条件测定15批合欢花药材和标准汤剂中槲皮苷的含量。结果见表3。

表3 合欢花标准汤剂槲皮苷含量、转移率考察

2.4 特征图谱

2.4.1 色谱条件 色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；以乙腈为流动相A，0.2%磷酸为流动相B，梯度洗脱(0～7 min，15%A；7～8 min，15%～16%A；10 min，16%A；10～11 min，16%～17%A；11～12 min，17%～18%A；12～13 min，18%～20%A；13～15 min，20%～25%A；17 min，25%A；17～18 min，25%～15%A；20 min，15%A)；流速：0.3 mL·min-1；检测波长：254 nm；柱温：35 ℃；进样量：1 μL。在此色谱条件下，各色谱峰与相邻峰的分离度良好且峰形对称。

注：A.合欢花标准煎液对照图谱；B.15批合欢花标准煎液特征图谱。图2 合欢花对照图谱及标准煎液UPLC图

2.4.2 对照品溶液制备 选用本品所含主要成分槲皮苷作为参照物。精密称取槲皮苷对照品适量，加无水乙醇配置成质量浓度为0.087 5 mg·mL-1的对照品溶液。

2.4.3 供试品溶液的制备 取2.1项下所得干膏粉约0.1 g，精密称定置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，称重，超声处理10 min，称重，用稀乙醇补重，滤过，即得。

2.4.4 方法学考察

2.4.4.1 精密度试验 精密称取同一批干粉(批号1706055)约0.1 g，按2.4.3项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液1 μL，连续进样6次，按2.4.1项下色谱条件进行测定，计算各相对峰面积的RSD值为0.22%，表明本法共有峰的RSD均小于5%，仪器精密度良好

2.4.4.2 稳定性试验 精密称取同一批干粉(批号1706055)约0.1 g，按2.4.3项下方法制备供试品溶液，进样量为1 μL，分别在0、3、6、9、12 h进样，按2.4.1项下色谱条件进行测定，计算各峰相对峰面积的RSD值均小于5%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.4.4.3 重复性试验 精密称取同一批干粉(批号1706055)样品约0.1 g，共6份，按2.4.3项下方法制备供试品溶液，进样量为1 μL，依照2.4.1项下色谱条件进样，结果表明，本法共有峰的RSD均小于5%，重复性良好。

2.4.5 特征图谱的建立 制备15批合欢花饮片标准汤剂的供试品溶液，按2.4.1项下色谱条件进样测定，得到15批合欢花标准煎液的特征图谱，并对色谱图进行匹配(采用“中药指纹图谱相似度评价系统”)，见图3，相似度结果见表4。由匹配图谱可以看出在合欢花标准汤剂中共标定出5个共有峰，色谱峰相似度分析结果表明，15批标准汤剂与对照图谱之间相似度均在0.9以上，表明15批合欢花饮片标准汤剂的质量稳定性良好。

图3 15批合欢花标准煎液特征图谱

批号170604117060421706043170604417060451706046170604717060481706049170605117060521706053170605417060551706056对照图谱17060411.0000.9490.9200.9710.9990.9790.9760.9720.9490.9680.9780.9710.9840.9790.9560.98117060420.9491.0000.9310.9580.9550.9670.9600.9210.9700.9670.9520.9620.9230.9630.9410.97317060430.9200.9311.0000.8710.9310.9350.9520.8800.9860.9820.9710.9410.9940.9230.9720.97017060440.9710.9580.8711.0000.9690.9810.9650.9750.9130.9350.9480.9770.8500.9900.9410.96317060450.9990.9550.9310.9691.0000.9790.9770.9710.9590.9750.9830.9740.9070.9790.9600.98617060460.9790.9670.9350.9810.9791.0000.9960.9600.9530.9650.9750.9890.9170.9950.9800.98817060470.9760.9600.9520.9650.9770.9961.0000.9470.9630.9700.9790.9870.9380.9900.9880.99117060480.9720.9210.8800.9750.9710.960.9471.0000.9040.9430.9660.9630.8430.9730.9410.95917060490.9490.9700.9860.9130.9590.9530.9630.9041.0000.9920.9760.9610.9800.9450.9670.98417060510.9680.9670.9820.9350.9750.9650.9700.9430.9921.0000.9940.9730.9670.9620.9770.99317060520.9780.9520.9710.9480.9830.9750.9790.9660.9760.9941.0000.9810.950.9750.9860.99517060530.9710.9620.9410.9770.9740.9890.9870.9630.9610.9730.9811.0000.9290.9930.9870.99017060540.8940.9230.9940.8500.9070.9170.9380.8430.9800.9670.9500.9291.0000.9050.9610.95517060550.9790.9630.9230.9900.9790.9950.9900.9730.9450.9620.9750.9930.9051.0000.9780.98617060560.9560.9410.9720.9410.9600.9800.9880.9410.9670.9770.9860.9870.9610.9781.0000.989对照图谱0.9810.9730.9700.9630.9860.9880.9910.9590.9840.9930.9950.9900.9550.9860.9891.000

3 讨论

本实验以出膏率及有效成分即槲皮苷的含量为衡量指标，分别对合欢花标准汤剂制备工艺的吸水率、加水量、煎煮时间、静置时间、筛网目数、浓缩温度进行了单因素考察，最后优选出最佳制备工艺，并且对标准煎液进行了出膏率、有效成分转移率、特征图谱的测定，其出膏率、含量、转移率均在规定的范围内。

中药指纹图谱在中药质量控制中占有很重要的地位，因为中药及其制剂是以其整体作为有效物质，中药指纹图谱能全面反映中药内在化学成分的种类与数量，进而反映中药的质量，符合中医中药整体性和模糊性的特点，在中药质量的综合评价和控制方面被认为是中药质量控制的里程碑[11-12]。本研究采用UPLC建立了合欢花标准汤剂的特征图谱，标定出含槲皮苷在内的5个共有峰，对15批合欢花饮片标准汤剂进行了相似度评价，其相似度均大于0.90，表明15批合欢花标准汤剂的质量稳定性良好。对指纹图谱所用的液相色谱方法进行了方法学考察，其重复性、精密度、稳定性的RSD值均小于5%，表明此方法可用于合欢花饮片及配方颗粒的质量控制，为合欢花标准汤剂、配方颗粒的质量标准和临床用药提供了科学的数据和多角度的研究思路。