Box-Behnken响应面法优选心痛宁胶囊的水提工艺△

刘怡，如扎·哈布都拉，李露，王萍，2，孟瑶，依孜提·帕力哈提，张丽娟，聂继红，2*

1.新疆医科大学，新疆 乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学第四临床医学院，新疆 乌鲁木齐 830000

心痛宁胶囊是国医大师沈宝藩教授以“痰瘀同治”为指导，临床应用三十余年的经验方。

它由丹参和红花等药材组成，可显著改善冠心病患者的临床症状。现代药理研究表明，方中丹参、红花等中药材具有抗血小板聚集、抗血栓形成等多重药理作用[1-5]。最初的处方是汤剂，后被开发成胶囊以便于携带和储存。

Box-Behnken响应面法是优化工艺条件的有效方法，广泛应用于多因素试验优化[6-7]。经过优选得到的心痛宁胶囊的水提工艺合理，可操作性强，为将来的生产提供参考。

1 材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪(Waters-2695)；紫外-可见分光光度计(Cintra20)；SI-234电子天平[丹佛仪器(北京)有限公司]；Direct-QTM5超纯水仪(Millipore)；xXMTD-4000型电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司)。

1.2 试药

丹酚酸B对照品、D-无水葡萄糖对照品(中国食品药品检定研究院)；磷酸为分析纯；甲醇、乙腈为色谱纯。

丹参、红花等药材饮片均购买于亳州市中正药材饮片有限公司，经检验符合2015版《中华人民共和国药典》收载各饮片项下的质量要求。

2 方法与结果

2.1 丹酚酸B的含量测定

2.1.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱Shield RP18(250 mm×4.6 mm，5m)；流动相：乙腈-0.1%磷酸(29∶71)；体积流量：1.0 mL·min-1；检测波长：286 nm；进样量：10 μL；柱温：30 ℃[8-10]。

2.1.2 对照品溶液的制备 称取精准适量对照品，通过使用色谱甲醇制备质量浓度为0.5 mg·mL-1的丹酚酸B储备液。

2.1.3 供试品溶液的制备 根据提出的试验方案，提取称重的水提取物并置于1000 mL圆底烧瓶中，加入10倍量水并加热回流1 h，冷却后，将提取液经纱布过滤，离心1 h后取上清液10 mL蒸干，在完全溶解5 mL甲醇后，溶解液用0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

注：A.丹酚酸B对照品；B.心痛宁胶囊水提液供试品；C.缺丹参的阳性对照。图1 心痛宁胶囊中丹酚酸B的含量测定结果图

2.1.4 阴性样品溶液的制备 称取不包括丹参在内其余拟水提的饮片，提取制备阴性样品溶液。

2.1.5 线性范围研究 准确测定在2.1.2项下丹酚酸B的储备液，用色谱甲醇分别稀释至0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·mL-1，分取这5个不同质量浓度梯度的溶液，注入液相色谱仪，得回归方程：Y=12 951 793X-32 554.7(r=0.999 9)，其中X为浓度，Y为对应的峰面积，体现在0.1～0.5 mg·mL-1线性关系良好。

2.1.6 精密度试验 取一份制备好的参比液，连续进样6次，试验最终得到的RSD值为0.54%，表明方法的精密度良好。

2.1.7 重复性试验 按照规定的方法并行准备6份试验溶液并分别进样，得到的峰面积的RSD值为1.44%，表明该方法重复性良好。

2.1.8 稳定性试验 取相同的试验溶液，在制备后的第0、6、8、12、24、48 h进样，丹酚酸B峰面积的RSD值为1.99%，说明该方法的稳定性良好。

2.1.9 加样回收率试验 取6份待测样品，从中吸取一定量，按同比量加入丹酚酸B参比物后记录其峰面积，结果平均加样回收率为103.48%，RSD值为1.11%，表明该分析方法准确。

2.2 总多糖的含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备 使用超纯水制备质量浓度为0.05 mg·mL-1的D-无水葡萄糖参比物储备溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 根据试验方案提取饮片并保存以备后用。

2.2.3 苯酚溶液的制备 用温水制取5%的苯酚溶液，低温贮存避光。

2.2.4 最大吸收波长的确定 分别精密吸收D-无水葡萄糖对照品溶液0.1 mL，将0.1 mL样品溶液置于1000 mL的量瓶中，用等体积的超纯水稀释，充分混匀，加入0.1 mL稀释剂，置于10 mL试管中，将5%苯酚溶液1 mL和浓硫酸溶液5 mL加入1 mL的超纯水中混合10 min，然后，将混合物在沸水中加热20 min，取出空白液体，并将混合物快速冷却至室温，并以相同的方式制备空白液体用于测量，扫描结果见图2，波长范围为350～700 nm[11-13]。结果表明，样品溶液和对照物在485.6 nm处有最大吸收。

2.2.5 标准曲线的制备 分别准确吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL储备液。在上述显色方法下分别测定其吸光度(A)。将吸光度作为纵坐标，将D-无水葡萄糖浓度作为横坐标，得回归方程：Y=14.58X+0.071 8(r=0.999 9)，说明D-无水葡萄糖在0.01～0.05 mg线性关系良好。

图2 总多糖紫外吸收光谱

2.2.6 精密度试验 准确吸量适当D-无水葡萄糖，按规定方法显色后连续测量6次，RSD值为0.26%，说明该方法的精密度良好。

2.2.7 重复性试验 根据测试方案平行制备6个样品，RSD值为0.42%，说明该方法重复性良好。

2.2.8 稳定性试验 准确吸收适量的试样溶液，分别于制备后的第0、30、60、90、120、150、180 min按上述方法显色，测定吸光度以获得RSD值为1.15%，表明样品溶液在3 h内较稳定。

2.2.9 加样回收率试验 取已知D-无水葡萄糖浓度的试样溶液，制备6个样品和对照品含量为1∶1的混合液，并通过上述方法测量吸光度，结果平均加样回收率为98.09%，RSD值为0.28%。

2.3 浸膏得率的测定

用移液管吸量50 mL供试品溶液上清液，放入已重量恒定的坩埚中，先在水浴锅中蒸干后转移至烘箱内，设置105 ℃后，干燥至恒定质量，取出，冷却，称重干燥器并计算提取物产量[14]。

(1)

2.4 提取工艺的研究

以加水倍量(X1)、提取时间(X2)和浸泡时间(X3)作为自变量来研究提取过程。以丹酚酸B、总多糖的含量及浸膏得率的综合评分为因变量，根据评价指标对水提工艺的影响，拟定综合评分=丹酚酸B×0.4+总黄酮×0.3+浸膏得率×0.3。

2.5 单因素试验

通过浸泡时间、加水量、提取时间，测试提取次数，并且基于分析结果来确定Box-Behnken响应面测试的因素范围[15-17]。

2.5.1 加水倍量初步考察 加水倍量的初始评价将提取次数固定为1次，提取时间固定为60 min，浸泡时间固定为30 min。依次考察加水倍量6、8、10、12倍时的综合评分，结果在加水10倍量时，综合评分最高。因此，作为响应面设计范围的加水倍量为8、10、12倍，最佳为10倍。

2.5.2 提取时间初步考察 提取时间初始评价将加水倍量固定为10倍，浸泡时间固定为30 min，提取次数固定为1次。依次考察提取30、60、90、120 min时的各组分含量，结果提取60 min时得到最高评分，因此，提取30、60、90 min作为响应表面设计范围，并且提取60 min是最佳的。

2.5.3 浸泡时间初步考察 浸泡时间初始评价将加水倍量固定为10倍，提取时间固定为60 min，提取时间固定为1次。浸泡时间依次为60、90、120、150 min，结果浸泡120 min时，综合评分达到最高。因此，作为响应面设计范围的浸泡时间为90、120、150 min，最佳浸泡时间为120 min。

2.5.4 提取次数的初步考察 初步将加水倍量固定为10倍，提取时间固定为60 min，浸泡时间固定为120 min。经过提取1、2和3次后，最终综合评分依次增加，因此提取次数确定为3次。

2.6 Box-Behnken响应面法优化提取工艺

基于单因素试验，确定了Box-Behnken响应面设计中各因素的适用范围[18]。Box-Behnken响应面设计采用加水倍量(X1)、提取时间(X2)和浸泡时间(X3)作为指标，按表1进行试验。提取次数固定为1次。结果见表2。

2.6.1 结果分析 利用方差分析对各因素进行多元二次回归，得到的回归方程Y=93.47+7.19X1+2.41X2+1.80X3-6.49X1X2-0.050X1X3-2.78X2X3-16.73X12-18.51X22-10.10X32，由表3可知，X1、X2、X1X2、X12、X22、X32的影响显著，影响程度为X1>X2>X3。失拟项P>0.05，回归方程可以更好地分析和预测本研究的水提过程。

2.6.2 响应面分析与优化 响应面分析和优化使用Design-Expert软件[19-20]，获得了加水倍量、提取时间、浸泡时间的综合评分的三维响应面图，结果见图3～4，能直接反映3个自变量与综合得分之间的相互作用。利用Design-Expert软件预测了最佳提取工艺：加水10.87倍，浸泡128.30 min，提取58.72 min。根据实际生产要求，确定了最佳的水提工艺流程：加水11倍，提取60 min，浸泡130 min，提取3次。

表1 Box-Behnken设计的因素及水平

表2 Box-Behnken设计及结果

表3 回归模型的方差分析

2.6.3 验证试验 根据最佳提取工艺，进行了3次平行验证试验，综合得分为99.56、98.34、99.84，平均综合得分为99.25(RSD为0.80%)，与预测值(94.33)一致。结果表明，该方法是合适的，优化后的提取工艺是合理可行的。

图3 各因素对综合评分的三维响应面图

图4 提取工艺对各因素之间的等高线图

3 讨论

丹参中富含的丹参酮和丹酚酸B有显著的抗血小板凝集作用，相比于含量低、稳定性差的丹参酮类成分，水溶性的酚酸类成分具有药理活性相对较强、含量高等特点，故本研究选用了易溶于水的丹酚酸B作为指标性成分。

参考2015年版《中华人民共和国药典》，采用乙腈-0.1%磷酸(22∶78)作为流动相测定丹酚酸B，但分离度及峰形效果不符合要求，因而调整了乙腈-0.1%磷酸的比例，最后将流动相确定为乙腈-0.1%磷酸(29∶71)。

Box-Behnken响应面法可以在因素和响应值之间建立模型，它不仅能拟合相关数据，筛选出最佳工艺，而且能够准确预测试验结果，精度高。另外，Box-Behnken响应面法克服了正交试验无法得到整体因素中的最佳组合及响应值的缺点，在未来中药领域的研究中将会得到广泛应用。本研究以丹酚酸B、总多糖含量和浸膏得率的综合评分为指标，运用Box-Behnken响应面法对心痛宁胶囊的水提工艺进行优化，建立了综合评分与各自变量之间的数学模型，为心痛宁胶囊的大规模生产提供参考。