陕产宽叶重楼的生药学研究△

程虎印，程江雪，王艳，张景霞，颜永刚，彭亮，杨新杰，高静

1.陕西中医药大学，陕西 西安 712046；2.陕西省微生物研究所，陕西 西安 710043

宽叶重楼ParispolyphyllaSm.var.latifoliaWang et Chang为百合科重楼属南重楼组药用植物，主要分布于我国山西、陕西西部、甘肃、安徽等地[1]，在陕西华阴市、耀州区、黄龙、镇巴县和秦岭南北坡多有分布，根茎入药，多生于海拔1000～1840 m的阴湿阔叶林下、沟边溪旁、林缘[2-8]。重楼属南重楼组具有极高的药用价值，其粗壮根茎所含重楼皂苷类成分具有止血、镇痛、抗炎拟菌、收缩子宫和抗肿瘤等活性，临床上常用于治疗子宫出血、泌尿系感染、外科炎症、癌症、避孕等[6，9-13]，2015版《中华人民共和国药典》收载中药重楼基原植物为百合科重楼属南重楼组的云南重楼ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.或七叶一枝花P.polyphyllaSmith var.chinensis(Franch.)Hara的干燥根茎[14]。宽叶重楼根茎在陕西多地当中药重楼使用，常用于止血、抗炎镇痛和癌症、肺系疾病、慢性胃病等治疗[6，8，13，15-16]。近年来重楼的市场需求快速增长、价格连年攀升，致使民间对粗壮根茎类的重楼属南重楼组野生资源进行了掠夺式的采掘，加上该类群繁殖率低、自然生长周期长、群落自然更替缓慢等因素，加剧了市场供给的资源压力，导致重楼中药资源遭到严重破坏而迅速减少，药材紧缺状况业已显现[5，8，17-19]。

南重楼组在我国许多地区有多种植物种类相混入药，其根茎在历史上、民间部分地区一直作为重楼使用[17，20-22]，均含2015版《中华人民共和国药典》规定的重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ等质量控制性有效组分[9，11，24-25]。目前对宽叶重楼的研究主要集中在化学成分[26]、ITS2鉴别[27]和非传统入药部位的化学成分[28-29]等方面，其生药学研究未见报道。为了探讨宽叶重楼质量可靠性和自然资源替代性，扩大重楼中药资源范围，保护云南重楼和七叶一枝花野生资源，本实验对宽叶重楼的生药性状和显微特征进行了观察研究，用HPLC法对重楼皂苷I、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的总含量进行了测定，报告如下。

1 器具用品

1.1 仪器

Nikon D7000数码照相机(株式会社尼康)；HD-300型自动脱水机、HD-310型石蜡包埋机、HD-310型包埋机专用冷冻台、HD-330型摊片拷片机、HD-360型生物组织自动染色机(湖北慧达仪器有限公司)；FA2104型电子分析天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)；LEICA RM2235切片机(德国徕卡公司)；ZEISS Imager.A2显微镜(德国蔡司公司)；UltiMate 3000 HPLC(Product of ThermoFisher)；GS-120-5-C18-BIO高效液相色谱柱(4.6 nmmID×250 nm，苏州环球色谱有限责任公司)。

1.2 试剂试药

重楼皂苷I、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ(批号依次为10575-201410、10576-201409、10577-201411、10578-201411)对照品，南昌贝塔生物科技有限公司，纯度≥98%；95%乙醇(分析醇)；甲醇(色谱醇gradient grade≥99.9%)；水为哇哈哈纯净水；乙腈(色谱乙腈gradient grade≥99.9%)；其余试剂均为分析纯。

1.3 材料

根据有关文献[30-33]和当地重楼药材采挖习惯，本实验用宽叶重楼的根茎生药样品均采自主产区阴湿的自然落叶阔叶林下或人工阔叶林下重楼仿野生种植基地(见表1)，实地采集的样品植株均在苗期6年以上，经王继涛高级实验师、颜永刚教授和课题组专家共同鉴定。

2 方法与结果

2.1 生物学特性

株高30～160 cm。根茎粗厚，横走，呈结节状不匀扁圆锥体，最初形成的根茎较细，此后逐步变粗，至顶部最粗(即：根茎的年生物量积累逐年增大)，略弯曲，表面棕红色至棕褐色，有层状突起横斜粗环纹，顶芽自7、8月间的花期末、果期初萌出，至次年3月实生苗出土前持续增粗、加长，芽长可至5～8 cm。叶5～19，叶柄长0.2～1.5 cm，有时带紫色；叶片宽卵状长圆形、宽披针形至倒长卵状披针形，长6～25 cm，宽2.6～6 cm，先端短尖，基部宽楔形，羽状网脉。花3至9数，花柄长于外轮花被片；内轮花被片线形至狭条形，宽0.5～1.5(2)mm，远长于外轮花被片；雄蕊6～18，花药与花丝近等长，药隔极短，长约0.1～0.2 mm；花柱3至9，细圆柱形，离生并外向反曲；花柱基盘状，棱角数与花数一致，紫色至深紫褐色；子房外壁具疣状突起，果时更加显著。果实球形，深绿色，直径2～5 cm，有多条钝纵棱，纵裂。种子球形，橘红色。花期4～7月，果期7～10月。见图1。

注：1.果实;2.种子;3.原植物;4.腊叶标本。图1 宽叶重楼的果实、种子特征及原植物、腊叶标本图

宽叶重楼的根茎长度与周长、株高、叶片数目及叶片长宽、花基数、果实直径及成熟种子数目常随生长年限的延长有不同程度的增加，生长习性具有生殖生长期较长、花期和初果期为根茎膨大期的生长规律。人工栽植过程中，如选择干旱、过度光照、粘质土壤等逆性生长环境，或移栽时机选择不当，则其年生长周期提前且缩短、地上部分生长不良、根茎自尾部渐次朽萎或生物量逐年减少，直至失亡。

宽叶重楼与重楼ParispolyphyllaSm.的最主要区别是：叶为宽卵状长圆形、宽披针形至倒长卵状披针形，宽2.6 cm以上；内轮花被片远长于外轮花被片；药隔极短，长约0.1～0.2 mm；子房或果皮外壁具疣状突起，果时更加显著。

2.2 生药性状

宽叶重楼生药为去芽、去须根的干燥根茎。生药呈结节状不匀扁圆柱体或圆锥体，略弯曲，长4.3～6.2 cm，直径0.6～3.5 cm。表面呈棕红色至棕褐色，有层状突起横斜环纹，结节明显，一端有凹陷茎痕或芽体切面，周身密布凹陷的白色须根痕或有残留须根，质地坚硬，断面乳白色，较平整，粉性强。气微，味微苦、麻。见图2。

图2 宽叶重楼生药性状特征

2.3 生药显微特征

2.3.1 根茎横切面 表皮细胞一至两层，壁栓化稍增厚，最外层外切向壁栓化显著、呈棕褐色，细胞排列紧密、无细胞间隙，细胞呈近圆形、类方形、不整齐长方形或三角形，少楔形。较粗根茎部分表皮破碎或剥落。

皮层宽广。外皮层3～6层，比表皮细胞稍大，有时因外层外切向壁稍栓化而呈浅褐色，排列较为整齐紧密，基本无细胞间隙，不含或少含淀粉粒。皮层薄壁细胞呈类长方形、类长圆形、类多角形，大小均基本等，排列不整齐，细胞间隙明显，约有31～40层，内含淀粉粒细胞的细胞直径约径12～36 μm，为生活细胞；含针晶束的细胞普遍较大，直径(长度)约21～78 μm，为死亡细胞，针晶束长32～60 μm，宽10～40 μm。皮层内可见根迹维管束，其维管束鞘由薄壁细胞构成，厚约9～13层，内有大型细胞间隙构成的通气组织。可见粘液细胞。内皮层细胞较小，长方形、切向延长，排列成不连续、不整齐的波状环形。皮层宽度与中柱半径的宽度比约为2～2.5∶1。

中柱结构为基本组织之中散布周木式维管束。中柱鞘不明显，薄壁细胞大小较为均等、排列不整齐、细胞间隙明显，富含淀粉粒、针晶束。有15～20个周木式维管束，多散布在中柱外围，呈椭圆形或不规则形，少数两至三个成群排列。可见粘液细胞腔。见图3。

2.3.2 生药粉末 呈白色，略带淡棕黄色。淀粉粒极多，呈球形、长圆形或钝三角形，大小差异显著，基本为单粒，复粒淀粉为三粒复合型和多粒团块型，较少，脐点明显，多为点状、条状、人字形及星状，层纹不明显，直径6～25 μm；草酸钙针晶极多，暗灰色，散在排列或呈束簇状排列，长度为12～71 μm，单个宽约5 μm；导管较常见，主要为螺纹、梯纹及梯-网纹导管，螺纹导管直径6～15 μm，有导管介于螺纹和梯纹之间，直径12～40 μm。见图4。

注：1.栓化表皮;2.皮层;3.维管束鞘;4.根迹;5.细胞间隙;6.草酸钙针晶;7.内皮层;8.周木式维管束;9.黏液细胞。图3 横切面结构部分详图及简图(10×4)

注：1.淀粉粒；2.针晶(束)；3.螺纹导管；4.环-梯纹导管；5.梯-网纹导管；6.梯纹导管。图4 生药粉末显微特征

2.4 HPLC法测定重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ总含量

2.4.1 色谱条件及系统适用性 色谱柱为Inertsil ODS(C18)(250 mm× 4.6 mm，5 μm)；检测波长：203 nm；柱温：25 ℃；流动相：水(A)-乙腈(B)梯度洗脱(见表2)，流速：1.0 mL·min-1；进样体积：30 μL。理论板数按重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ计算均不低于10 000。对照品、样品的HPLC图见图5。

表2 梯度洗脱程序表

注：1.重楼皂苷Ⅶ；2.重楼皂苷Ⅵ；3.重楼皂苷Ⅱ；4.重楼皂苷Ⅰ。

注：1.重楼皂苷Ⅶ;2.重楼皂苷Ⅵ;3.重楼皂苷Ⅱ;4.重楼皂苷Ⅰ。图5 重楼混合对照品(A)及样品(B)的HPLC色谱图

2.4.2 溶液的制备 对照品溶液的配制：精密称取重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅵ和重楼皂苷Ⅶ 2 mg，分别置于5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成浓度为0.4 mg·mL-1的对照品溶液，备用；精密吸取上述4种对照品溶液各1.5 mL，置于统一10 mL容量瓶中，摇匀，用甲醇定容，即得混合对照品储备液。

供试品的制备：将宽叶重楼根茎粉碎成粗粉，精密称取药材粉末2.0 g，置于锥形瓶中，加入25 mL 90%乙醇，浸泡0.5 h后，连续回流提取2次，合并滤液，完全蒸发续滤液中溶剂，向其中加入甲醇溶解，并定容至10 mL容量瓶内，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.4.3 方法学的考察 按相关标准进行方法学试验，结果，精密度、稳定性、重复性以及加样回收率试验中，供试品的峰面积RSD值均在规定范围内，表明方法精密度、供试品溶液稳定性、方法重复性较好。

2.4.4 宽叶重楼药材样品有效组分的含量测定 取10批8月采集的宽叶重楼药材样品各适量，分别按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，并以干燥品计算含量。结果见表3。

表3 10批8月采集宽叶重楼药材的有效组分含量测定结果 %

测定结果表明，宽叶重楼药材中重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的总含量均在3%以上，符合2015版《中华人民共和国药典》“重楼”项下标准。

3 结论

陕产重楼属南重楼组有2种6变种(含云南重楼和七叶一枝花)均为中药重楼的来源植物[8]，宽叶重楼的叶片宽2.6 cm以上、内轮花被片远长于外轮花被片、子房外壁或外果皮的疣状凸起等特征与重楼易于区别。但长期以来，宽叶重楼常被当做“灯台七”使用[2-8]，大众认知与入药均混同于重楼其它粗壮根茎的类群。本研究厘清了宽叶重楼的识别特征、生药来源、生长习性及陕西省主要分布区，以正本清源。

根茎横切面显微结构中具有1至2层表皮、内皮层排列成不连续的波状环形、15～20个小型散布周木式维管束等横切面特征性结构，根迹维管束鞘内有类似于通气组织的大型细胞间隙，与其阴湿的生长环境相辅[34]，连同点状、条状、人字形及星状脐点的(钝)球形淀粉粒等生药粉末特征，与七叶一枝花和云南重楼1层表皮、断续排列的内皮层、25个以上小型散布周木维管束、生药粉末中淀粉粒等特征[13，35]有显著区别，是标志性显微鉴别指标。

宽叶重楼生药有效组分重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ总含量超过了2015版《中华人民共和国药典》0.6%的指标，就本实验而言，宽叶重楼药材以实生苗生长年限6年以上、株高100 cm以上、采集时间在8月间较为适宜，与李艳敏等[32]、童凯等[33]甾体皂苷总含量因阔叶形、茎高增加、随生长年限延长而增加等研究结果一致；也表明它在自然分布区的海拔区限内的质量无显著差异；与七叶一枝花、云南重楼的原植物来源、性状、显微特征及4种重楼皂苷类有效组分有相似性，说明二者具有质量相似性，在一定程度上印证了陕西民间、历史上和中药原料药市场将它作为重楼同名等效药用[2-8，15-17]的合理性，在资源上相互替代的可行性和药理活性值得进一步研究和。

本实验对宽叶重楼的生物学特征和生药学研究结果，将为陕西寻求中药重楼替代资源、制订宽叶重楼质量标准、研究陕产重楼属其它类群的生药学特征奠定了基础，充分利用药典收载种类的生物学信息[36]和种苗繁育技术[37-38]合理开发陕西特色资源。