两种甘草种子伪品的鉴别△

尚兴朴，邓庭伟，曾燕，郑司浩，王继永，*，史玉宝，杨连兵，卢祯林，王凯

1.中国中药有限公司，北京 100195；2.国药种业有限公司，北京 102600；3.甘肃工业职业技术学院，甘肃 天水 741025

甘草GlycyrrhizauralensisFisch.是豆科Leguminosae甘草属Glycyrrhiza多年生植物[1]，在我国集中分布于三北地区[2]，是构成我国北方荒漠植被的重要植物，具备生态和经济的双重价值[3]。近年来随着生态环境的破坏及无节制的采挖，甘草资源状况日益严峻[4]，为满足日益增长的市场需求，人工甘草的种植面积逐年增加，甘草种子价格也逐年攀升。魏建和等[4]收集了3个省份的甘草种子，发现甘草种子质量差异较大，绿籽的质量显著高于黑籽。孙群等[6]研究了10份市售甘草种子的质量，发现市售甘草种子质量良莠不齐，净度、发芽率、硬实等差异较大。王立平等[7]分析了4份市售甘草种子的发芽率，其中灰绿色种子发芽率最高。于福来等[8]初步建立了甘草种子的质量检验方法。

为充分了解市售甘草种子的质量及市场行情，2018年5月～8月，笔者前往内蒙古、甘肃、新疆、宁夏等地展开调研，发现除了种子质量差异较大外，更严重的是市场上出现了两种甘草种子伪品，其种子形态、皮色等与甘草种子差异不明显，若混杂于甘草种子中，种植户较难辨识。赵文吉等[9]曾在调研中发现，市场中经营中药材种子种苗的大部分从业人员缺乏对种子种苗真伪鉴别等的专业知识。所以，本实验采用种子质量检验与DNA序列分析相结合的方法展开甘草种子伪品的鉴别研究，以期为甘草种子经营者及种植户提供两种甘草种子伪品的鉴别技术方法，达到推动甘草种子市场良性发展的目的。

1 材料与方法

1.1 材料

2018年8月，笔者调研时发现市售甘草种子中掺有两种类似甘草种子的种子，其中一种类似于生产经营中称为“黑籽”的黑色种子[5]，一种种皮颜色为棕色但形状为“葫芦状”的种子，分别取名为“黑豆子”、“葫芦子”，编号为HZ、HL，每种市售甘草种子各取样1 kg作为研究材料，采用杭锦旗甘草种子做对照样品，编号为GC。具体信息见表1。

表1 市售甘草种子样品信息表

1.2 方法

1.2.1 种子质量检验

1.2.1.1 种子净度的测定 按GB/T 3543.3—“农作物种子检验规程”净度分析执行。结合10目和8目筛子，在不损伤发芽力的基础上进行检查，直接挑选纯净种子。[8]每份种子随机选取10 g，3次重复测定甘草种子伪品、其他杂质和净甘草种子的质量。

1.2.1.2 种子千粒质量的测定 采用百粒法测定“黑豆子”、“葫芦子”及甘草种子的千粒质量[8]，随机数取100粒，重复5次，分别记录百粒质量。

1.2.1.3 种子形态指标的测定 随机选取10粒“黑豆子”、“葫芦子”及甘草种子，用游标卡尺测定种子的长、宽和种子厚度，重复5次。[10]

1.2.1.4 种子真实性鉴定 对“黑豆子”、“葫芦子”及甘草种子的形态、表面特征和种子颜色进行鉴定。

1.2.2 DNA序列分析

1.2.2.1 DNA提取 每份样品种子选取10粒，单粒切碎后，用FRITSCH P6球磨仪(德国Fritsch公司)进行完全粉碎。采用植物组织提取试剂盒(Tiangen Biotech Co.，China)提取总DNA，-20 ℃保存。

1.2.2.2 PCR扩增及测序 ITS序列扩增及PCR条件参照文献[10]，正向引物ITS 5F为5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′，反向引物 ITS 4R为5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR反应体系为25 μL，包括2 μL DNA，12.5 μL 2×Taq plus PCR Master Mix，各1 μL(10 μmol·L-1)引物(上海美吉生物医药科技有限公司)，8.5 μL H2O。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，30个循环；72 ℃延伸7 min。PCR扩增产物送上海美吉生物医药科技有限公司进行双向测序。

1.2.2.3 数据处理 用CodonCode Aligner V5.1.5(Codon Code Co.，USA)软件对测序后获得的ITS序列结果进行校对和序列拼接，去除低质量序列及引物区，采用 MEGA 6.05(Molecular evolutionary genetics analysis)进行比对分析，修剪后的ITS序列提交NCBI(National Center for Biotechnology Information)进行BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)序列比对分析。

2 结果与分析

2.1 种子质量检验分析

2.1.1 种子净度分析 种子净度分析结果见表2，3份市售甘草种子样品中，甘草种子伪品的平均占比分别为50.59%(“黑豆子”)、46.24%(“葫芦子”)、0，净甘草种子的平均占比分别为39.44%、44.87%、98.16%。结果表明，市售甘草种子1、2中净甘草种子的占比均不足50%，严重的影响了正常甘草种子的质量；而市售甘草种子3的净度在98%以上，符合甘肃省(≥98%)[12]、安徽省(≥97%)[13]、北京市(≥95%)[14]的甘草种子地方标准。

表2 3份样品种子净度测定

2.1.2 种子千粒质量、形态指标的测定及真实性鉴定 种子千粒质量、形态指标的测定结果见表3，结果显示“黑豆子”HZ的千粒质量、长、宽、厚均大“葫芦子”HL、甘草种子GC，除厚度外也均超出于福来等[7]对甘草种子真实性鉴定的最大值，“葫芦子”HL与甘草种子GC的千粒质量、长、宽、厚相近，从数据上暂时较难进行区分。

通过对“黑豆子”、“葫芦子”及甘草种子的表面特征和颜色观察(见图1)发现，HZ呈肾圆形，两端钝圆，表面黑色，无光泽，种脐位于腹部凹陷处；HL呈葫芦状，上窄下宽，表面暗棕色，略有光泽，种脐不明显，种皮较坚硬；GC呈肾圆形，两端钝圆，表面黄绿色至暗绿色，光滑，略有光泽，种脐位于腹部凹陷处。仅GC形态符合于福来等[8]对甘草种子的真实性鉴定。

表3 甘草种子及其伪品的千粒质量与大小

注：GC.甘草种子；HZ.“黑豆子”；HL.“葫芦子”图1 甘草种子形态对比图

2.2 DNA碱基序列分析

通过对30份ITS序列的测序结果进行校对、拼接、比对发现，三者的碱基序列存在明显差异，碱基相似度极低，修剪后的序列长度分别为627 bp、636 bp、389 bp。单倍型分析发现，HZ仅有1种单倍型，HL共有4种单倍型，GC有1种单倍型。分别将三者不同单倍型的碱基序列提交NCBI进行BLAST比对分析，结果见表4。DNA碱基序列结果表明，HZ、HL均不是甘草种子，HZ的碱基序列BLAST结果为豆科野决明属种子，HL 4种单倍型的BLAST结果为漆树科盐肤木属或者苦木科鸦胆子属种子，两者均为甘草种子伪品，而市售甘草种子3杭锦旗种子为甘草种子。

3 讨论与结论

3.1 市售甘草种子现状与真假鉴别

通过市场调研发现，目前市场上流通的甘草种

子主要为乌拉尔甘草种子，种子质量不仅存在净度、发芽率、硬实等差异均较大的问题，还存在不同产区甘草种子混杂销售、产新种子与陈旧种子混杂销售等现象，更严重的是出现了两种其他植物种子冒充甘草种子销售的现象。本实验从种子质量检验、DNA碱基序列分析方面着手展开研究，种子净度的高低是决定种子质量优劣的关键因素之一，高净度的种子可有效降低种植户的用种量及成本；种子千粒质量是衡量种子质量的主要指标[10]，同时也是种子质量分级的衡量标准之一；种子形态观察为种子真实性鉴定提供了一种直观、有效的鉴别方式，在具备相关专业知识的基础上，可迅速及时的做出真假种子的鉴别；DNA条形码技术是中药材种子种苗鉴定的有效手段[11]，具有快速、准确、费用低等优点，可实现对未知物种的鉴定[15]，研究结果表明甘草种子及其伪品间存在较大差异，该方法可成为甘草种子经营者及种植户鉴别市售甘草种子伪品的有效技术手段。

3.2 DNA条形码技术的应用

DNA条形码是指利用基因组中一段公认标准的、相对较短的 DNA 片段作为物种标记而建立的一种新的生物鉴定方法，由加拿大分类学家 PaulHebert于2003年首次提出[16]。随着分子生物学的发展，DNA条形码技术的运用逐渐进入到了药材及种子种苗鉴定的范畴，是经典分类学方法的有力补充和革命性突破，其依赖于植物的遗传特征，不受植物生长时期的影响，所以对于中药材种子种苗的鉴定具有特别重要的意义[11，17-20]。本文将DNA条形码技术用于3种市售甘草种子及其伪品的鉴别研究，结果表明，ITS序列可有效区分“黑豆子”、“葫芦子”及甘草种子，有效地避免了依赖于植物形态和性状的传统鉴定方法的局限性。该技术可成功用于市售甘草种子的鉴别，对于保障甘草种子的真实性，保障人工种植甘草的质量、甘草经营户或种植户的生产效益，甚至甘草产业的良性发展具有重要的现实意义。

表4 样品BLAST鉴定结果

3.3 中药材种业现状与展望

种好，苗好，药材好。中药材种子种苗是药材生产的最基本、最重要的生产资料[11]，中药材种业作为中药材产业的源头，其质量是决定药材品质的关键因素和先决条件。而我国中药材种业尚未形成独立的产业，仍然是药材生产的附属，处于一种自产自销的原始生产状态，中药材种业的产业化进程处于起步阶段。在此背景条件下，市售中药材种子难免存在质量参差不齐、掺假售假现象。为此，笔者认为应尽快出台《中药材种子管理办法》，规范中药材种子生产和经营行为，培育中药材种子龙头企业，推动中药材产业健康发展。同时，应当着力开展中药材种子质量标准化研究，形成统一的检验技术规范，为推进中药材种业标准化、产业化发展提供技术支撑。