艳山姜风味发酵酒工艺条件的优化

黄 彭， 伍 琼， 冯瑞章， 杨胡艳， 彭显清， 董守超， 魏 琴*

(1.宜宾学院 固态发酵资源利用四川省重点实验室，四川 宜宾 644000；2.宜宾学院 生命科学与食品工程学院，四川 宜宾 644000)

艳山姜[Alpiniazerumbet(Pers) Burttet Smith]是集药用、食用、观赏和水土保持于一体的多年从生草本植物[1-4]。其精油中富含樟脑(camphor)、香桧烯(sabinene)、γ-松油烯(γ-terpinene)、松油烯-4-醇、α-蒎烯(α-pinene)、石竹烯氧化物(caryophyllene oxide)等功能活性成分[5]，具有降压、降脂、降低窦性心律和降低心肌肥厚等作用[6-8]。此外，艳山姜还含有黄酮类、酚类、吡喃酮类、二萜类和有机酸类等物质，具有抗菌、抗氧化、镇痛抗炎、调节神经系统等多种生物活性[9-10]，具有较好的经济开发价值。因此，艳山姜在我国东南部至西南部均有分布和种植，产量较高，资源丰富，但由于目前规模较大，生产管理粗放，上市时间较集中；加之基础性研究薄弱，产品开发单一，产业链短小，严重影响种植者的收益和积极性。

保健型饮料酒主要是用高度白酒或食用酒精浸泡而成，原料中很多营养和风味物质不能充分进入酒中。随着微生物技术的快速发展，人民健康意识的提高，浸泡型保健饮料逐步向低度发酵型保健酒转变，通过微生物的代谢过程，能将原料中的一些营养、功能性物质经发酵后保留在液体中，从而提高产品的营养价值[11]。笔者等以艳山姜果实为原料，在单因素试验基础上，筛选出对发酵工艺影响较大的因素进行正交优化试验，以期为艳山姜风味发酵酒的开发奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 生物材料 艳山姜，采自宜宾市屏山县八一专业合作社。安琪活性干酵母(RH、EC1118、DV10、QA23、果酒酵母)，湖北安琪活性干酵母有限公司生产；酵母菌Z9Y-91、S432Y-42，由宜宾学院固态发酵资源利用四川省重点实验室提供。

1.1.2 试剂 葡萄糖、明胶、柠檬酸、酵母膏，为食品级；氢氧化钠、亚硫酸、盐酸等试剂，均为分析纯；白砂糖，市售。

1.1.3 仪器与设备 LG10-2.4A型高速离心机，北京中兴伟业仪器有限公司；303A型电热恒温培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；生化培养箱，上海科学仪器厂；PHS-3B型精密pH计，上海雷诺仪器厂；超净工作台，苏州净化设备有限公司；酒精计，上海雷诺仪器厂；CNT95数字折射计，杭州路恒生物科技有限公司。

1.2 工艺流程及操作要点

1.2.1 工艺流程 菌种筛选→菌种活化→原料筛选→粉碎、过筛→发酵液制备→主发酵→后发酵→陈酿→澄清过滤→灌装→成品。

1.2.2 操作要点

1) 原料。挑选色泽纯正、无变质，风味浓厚的生晒艳山姜果实。

2) 粉碎。艳山姜果实经恒温鼓风干燥箱55℃干燥5 h后，经粉碎机粉碎，过40目筛备用。

3) 酵母活化。称取所需质量活性干酵母，将其加入到35～38℃、4%蔗糖溶液中，干酵母与糖水质量比为1∶10(即活性干酵母添加量为10%)，不断搅拌混匀，恒温水浴20～30 min活化酵母。

4) 发酵液制备。因艳山姜果实总糖含量少，在试验中忽略不计。酿造酒精度为12%的艳山姜风味发酵酒(按17.5 g/L蔗糖经酵母发酵产生酒精度1%来添加蔗糖)，用0.8%柠檬酸调节发酵液的pH，加入原料制成发酵液。

5) 主发酵。将发酵液放入发酵罐，接种活化好的酵母，以料液比、酵母接种量、起始pH、主发酵温度和主发酵周期等5个因素分别进行单因素试验。发酵结束后，测定发酵醪液的酒精度并进行感官评分，以确定发酵的最佳单因素条件后，通过L9(34)正交试验确定最佳工艺组合。

6) 后发酵。主发酵结束后，用多层纱布过滤，分离发酵瓶底部大量的沉淀与汁液，将汁液保持在15～20℃条件下进行后发酵20 d。

7) 陈酿、澄清、过滤。后发酵结束后进入陈酿期，陈酿温度控制在15℃以下，密闭放置20 d，再采用0.05%明胶澄清酒液。最后用2 μm滤膜过滤艳山姜风味发酵酒，除去大分子颗粒物质、酵母菌及其他微生物，使酒质更加柔和，保存时间更长。

1.3 优势菌种的筛选

从果酒酵母、安琪活性干酵母RH、QA23、EC1118、S432Y-42、DV10和Z9Y-91共7株酵母中筛选艳山姜风味发酵酒发酵的优势菌种。优势菌种筛选试验采取小容器发酵，发酵容器为150 mL的玻璃三角瓶，蔗糖水调至可溶性固形物为20%，原料添加量为1%，分别量取100 mL醪液于7个发酵瓶中，酵母添加量为0.4%，在30℃条件下恒温发酵7 d，以发酵体系中的酒精度和感官评分为评价指标，筛选出最适宜艳山姜发酵的菌种。

1.4 发酵工艺单因素试验

在发酵过程中分别以料液比、主发酵温度[12]、起始pH、酵母添加量[13]、发酵周期为单一变量设计单因素试验。当料液比为0%、2%、4%、8%、16%时，固定条件为酵母接种量4%、主发酵温度30℃、起始pH 4.0、培养时间7 d，检测酒精度并进行感官品评，筛选适宜的料液比；在此基础上，以主发酵温度15℃、20℃、25℃、30℃、35℃进行试验，固定起始pH 4.0、酵母接种量4%、培养时间7 d，筛选适宜的发酵温度；以起始pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，固定条件为酵母接种量4%、培养时间7 d，筛选适宜的起始pH；以酵母接种量为0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%，固定条件为培养时间7 d，筛选适宜的酵母接种量；最后以主发酵周期为3 d、7 d、11 d、15 d、19 d，筛选适宜的发酵周期[14-18]。

1.5 发酵工艺正交试验

根据单因素试验，选取对艳山姜风味发酵酒工艺影响较大的主发酵温度、起始pH、菌种添加量、料液比进行L9(34)正交试验(表1)，以成品酒的酒精度、感官评分为衡量指标，对发酵工艺参数进行优选[19]。并将优化的最佳发酵条件进行3组平行验证试验。

表1 艳山姜风味发酵酒工艺正交试验的因素及水平

1.6 指标测定方法

酒精度用酒精计法测定，参照国标GB/T 15038-2006；糖度用DNS法；总酸度用指示剂法，参照国标GB/T 15038-2006；pH用pH计法。

1.7 感官评定与综合评价

对成品酒进行感官评价，综合确定发酵的参数和发酵的程度，使成品更符合消费者的需求，根据GB 15038-2006和文献[20-21]的感官评价方法制定评分标准(表2)，选择10位食品专业学生进行感官品评，评定结果为10人的平均分。以酒精度和感官评分各50%的权重进行综合评价。

表2成品酒的感官评价项目及评分标准

Table 2 Sensory evaluation items and scoring standard ofA.zerumbetflavor fermented wine

1.8 数据处理

试验数据用EXCEL 2010软件和SPSS软件的Duncan法进行处理。

2 结果与分析

2.1 菌种筛选

从表3可知，在7种酵母菌中起酵速度为RH>QA23>EC1118>S432Y-42>果酒酵母>DV10>Z9Y-91；安琪活性干酵母RH发酵的酒精度最高，达6.26%，且酒体金黄，口感醇厚，典型性良好，感官评分为(81.67±1.53)分。综合发酵速度、酒精度和感官评分，以安琪活性干酵母RH作为艳山姜风味发酵酒的优势菌株。

表3不同菌种发酵艳山姜风味酒的酒精度和感官评分

Table 3 Alcoholic strength and sensory score of different yeast strains forA.zerumbetflavor fermented wine

2.2 不同发酵因素艳山姜风味发酵酒的品质

从图1可看出不同发酵因素对艳山姜风味发酵酒品质的影响。

2.2.1 料液比 以5种料液比进行艳山姜风味发酵时，原料对酵母生长表现出明显的抑制作用。原料添加过多会产生苦味，过少风味特征不足，影响口感，料液比为4%时感官评分最高。综合酒精度和感官评分，以料液比4%为最适添加量。

图1 不同发酵因素下艳山姜风味发酵酒的品质

2.2.2 主发酵温度 温度过低，酵母自身生长繁殖受到抑制，代谢能力降低，造成起酵慢且产酒效率低，产生的香味物质少。艳山姜风味发酵酒的酒精度、感官评分随发酵温度升高呈先上升后下降趋势，当主发酵温度为25℃时，酒精度、感官评分均最高，分别为3.22%和(79.0±1.63)分。

2.2.3 起始pH 当起始pH为4.0时，酒精度、感官评分最高，分别为3.63%和(82.33±2.05)分。同时发现，pH较高时，酒体颜色较深，品质下降，这可能是因为杂菌生长消耗营养物质，产生副代谢产物，酒精度和感官评分均下降。综合考虑，艳山姜风味发酵酒的起始pH以4.0为宜。

2.2.4 菌种添加量 一般酵母添加量越大发酵越快，发酵周期缩短，但风味物质形成受到影响，所得发酵酒酒体粗糙，而且大量的酵母泥会影响产品风味；添加量减少，则发酵慢，残糖量增多，风味寡淡，发酵酒的有效成分减少。综合酒精度、感官评分和节约性考虑，艳山姜风味发酵酒的酵母接种量以1.0%最佳。

2.2.5 主发酵周期 随着发酵周期延长艳山姜风味发酵酒的酒精度和感官品质上升，但时间过长酒精度增加缓慢，容易导致杂菌生长，使酒体酸度上升，产生酸涩味。从缩短生产周期、增大效益和感官评分考虑，艳山姜风味发酵酒的发酵周期以11 d为宜。

2.3 发酵工艺的优化

从表4可知，对艳山姜风味发酵酒酒精度的影响程度为B>A>C>D，对感官评分的影响程度为B>A>D>C。根据各指标不同水平平均值确定各因素的优化水平组合，其中，酒精度的较优方案为A3B2C1D3，感官评分的较优方案为A2B3C1D2，2个指标单独分析的优化条件不一致，因此根据因素影响主次进行综合分析。对于因素A、B，感官评分及对酒精度的影响均排第一位，确定为主要因素，当因素A取A2时，酒精度比取A3时高，但差异较小；取A3时，艳山姜风味发酵酒的醇溶性物质增多，风味特征较良好，因此，因素A取A3；同理，因素B取B2，因素C取C3，因素D取D1。艳山姜风味发酵酒发酵的最优方案为A3B2C3D1，即最佳发酵条件为料液比5%、发酵温度25℃、起始pH为4.0和酵母添加量0.9%。

2.4 验证试验

从表5可知，经最佳发酵条件所得艳山姜风味发酵酒的酒精度、感官评分的RSD均小于2%，表明试验有较好的重复性，感官评分和酒精度较高，平均为90.33分和9.46%，艳山姜风味发酵酒酒体透明、澄清、无悬浮物或沉淀物；色泽金黄、酒香协调柔和、香味浓郁；调和适当，无异杂味；风格良好，具有艳山姜的独特风味。

表4 艳山姜风味发酵酒工艺的正交试验结果

表5 最佳工艺重复性试验结果

2.5 理化与质量指标

经测定，艳山姜风味发酵酒成品酒的总糖为(5.56±0.43)g/L、总酸为(4.80±0.24)g/L、酒精度为10.05%、感官评分为(90.67±2.08)分。细菌总数≤50 cfu/mL，大肠菌群≤30 MPN/100 mL，未检测出致病菌，污染物限量、真菌毒素限量、微生物限量分别符合GB 2762-2016、GB 2761-2016和GB 2758-2016规定。

3 小结

试验结果表明，适宜艳山姜风味发酵酒的酵母为安琪活性干酵母RH，其发酵的最佳工艺条件为酵母添加量0.9%、料液比为5%、起始pH 4.0、主发酵温度25℃、主发酵周期11 d。在此条件下，发酵的产品酒精度达10.05%，糖度为(5.56±0.43)g/L，酸度为(4.80±0.24)g/L，酒体澄清透明，色泽金黄，口感醇厚，具有艳山姜的特殊气味，感官评分达(90.67±2.08)分。

艳山姜姜汁具有促进肠道蠕动和胃排空的功效[22-23]，艳山姜风味发酵酒是否也具备该功效，仍需经相关试验论证。由于艳山姜本身含有大量功能活性物质，具有一定的抑菌作用，为了提高发酵效率，在酵母活化过程中添加少量艳山姜汁液进行菌种驯化，培育适宜艳山姜发酵液的高效菌株，再接种到发酵液中。本试验仅对已有菌种进行筛选，未对强抗艳山姜抑菌的菌种选育，相关试验还需进一步研究完善。