百草枯中毒大鼠肺组织ACE2/ Ang-(l-7)/Mas受体表达变化及氯沙坦的干预作用

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百草枯(Paraquat, PQ)是目前国内广泛应用的除草剂，中毒后其病死率可高达90%[1]，目前尚无特异有效的PQ中毒的治疗药物，因此，针对百草枯中毒治疗药物的研究迫在眉睫。

肾素-血管紧张素系统(RAS)包括经典的血管紧张素转化酶(ACE)/血管紧张素II(Ang II)/ 血管紧张素转化酶1型受体(AT1R)轴与新近发现的血管紧张素转化酶2(ACE2)/血管紧张素(1-7)[Ang-(l-7)]/Mas受体轴，后者对前者起负向调节作用[2]。有报道，RAS与肺损伤、肺纤维化及肺动脉高压等多种呼吸系统疾病的发病相关[3]。本实验旨在观察中毒大鼠肺组织中Ang II 及ACE2/Ang-(1-7)/Mas受体轴的表达，并观察血管紧张素转化酶受体拮抗剂氯沙坦对其表达的影响，探寻百草枯中毒治疗的新靶点。

1 实验材料及方法

1.1 实验动物分组及标本采集 健康雄性SD大鼠54只，体重(200±30)g，清洁级，购于西南医科大学实验动物中心，按随机原则分为3组：对照组(N组)、染毒组(PQ组)、干预组(L组)，每组18只。 PQ组及L组：一次性腹腔注射百草枯溶液(18mg/kg)，N组以等量生理盐水替代。L组半小时后予氯沙坦溶液(10mg/kg/d)灌胃，按实验时间第3天(3d)、7天(7d)、21天(21d)分为3个亚组，每亚组6只。3d、21d亚组行Micro CT扫描。第3d、7d、21d处死各亚组大鼠，完整取出肺组织，HE染色及Masson染色确定肺泡炎及肺纤维化程度，ELISA法检测肺匀浆液中Ang II及Ang-(1-7)含量，免疫组化检测ACE2及Mas受体蛋白表达。

1.2 主要实验试剂 20%百草枯溶液购自安徽美科达农化有限公司，氯沙坦钾片剂购自杭州默沙东公司， Ang-(1-7)及Ang II酶联免疫测定试剂盒购自北京诚林生物科技公司，兔抗鼠ACE2多克隆抗体购自北京博奥森公司，Mas受体单克隆抗体购自美国Santa Cruz 公司。

1.3 大鼠活体肺组织Micro CT检查 扫描参数设置：管电压50kVp，管电流500μA，扫描模式360°，曝光时间1000ms，探测器组件模式4×4，平均帧数2，扫描时间约10min。

1.4 肺泡炎、肺纤维化程度判断 参照Szapie等[4]的方法用HE染色确定肺泡炎的程度，Masson染色确定肺纤维的程度，均分为4级，由轻至重分别记为 0、1、2、3分。显微镜下观察肺组织的病理学变化，随机取5个视野计算其平均值作为最后得分。

1.5 ELISA 测定肺组织匀浆中Ang II、Ang-(1-7)含量 每组大鼠取左肺组织适量，制备肺组织匀浆，取匀浆上清，生理盐水稀释为10%肺组织匀浆检测Ang II及Ang-(1-7)含量。操作按ELISA 试剂盒说明书步骤讲行。

1.6 免疫组化法测定ACE2及Mas受体在肺组织中的表达 兔抗鼠ACE2多克隆抗体及Mas受体单克隆抗体以1:200稀释。经烤片、脱蜡、脱水、灭活内源性过氧化物酶、抗原修复后加一抗，4℃冰箱孵育过夜，次日滴加生物素标记二抗，37℃冰箱孵育，DAB染色，苏木素复染，脱水、透明、干燥、封片。显微镜下观察，每张切片随机选取5个视野，应用Image-Pro Plus图像分析系统测出每个视野的光密度值和面积，得出其单位面积的平均光密度值(OD) 平均值表示蛋白表达。

2 结 果

2.1 大鼠一般情况 PQ组大鼠中毒后逐渐出现精神萎靡，活动、进食及饮水减少，步态不稳，呼吸急促，口唇发绀，体重下降，上述症状随中毒时间延长逐渐明显。L组大鼠情况有所改善，精神饮食尚可，体重下降较PQ组大鼠少。N组大鼠表现正常。

1.2 肺部Micro CT 影像学表现 大鼠俯卧位Micro CT显示：N组大鼠双肺纹理清晰、未见异常密度影。PQ组大鼠中毒后第3d部份肺纹理模糊，可见部份区域肺呈斑片状密度增高影，第21d肺斑片状高密度影范围扩大，可见肺纤维化及蜂窝样改变。L组大鼠第3d及第21d上述表现较PQ组减轻(图1)。

图1 3组大鼠肺Micro CT影像学表现

2.3 肺组织HE染色及Masson染色 N组大鼠肺组织HE染色可见肺泡结构正常，无充血、水肿及出血，肺泡间隔无增厚，Masson染色显示支气管周围有少量蓝绿色胶原纤维。PQ组大鼠3d、7d亚组中肺组织HE染色可见明显肺泡炎症表现，肺泡结构破坏，肺泡腔内可见水肿液，肺泡毛细血管充血、出血，肺泡间隔增厚，大量炎症细胞浸润， Masson染色可见7d亚组出现支气管周围及肺泡间隔染成蓝绿色的胶原纤维，随着时间的延长胶原纤维增加，以第21d亚组最明显。L组大鼠上述时间点肺组织的病理变化与PQ组的改变相似，但病变程度较PQ组轻(图2及图3)。

图2 肺组织HE染色(×100)

2.4 各组肺泡炎程度积分及肺纤维化程度积分比较 肺泡炎程度积分比较，PQ组及L组大鼠第3d、7d肺泡炎程度积分较N组明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)；与PQ组比较，L组第3d、7d的积分均减低，差异有统计学意义(P<0.05)，但第21d三组积分比较无明显差异。肺纤维化程度积分比较，PQ组及L组大鼠第7d、21d肺纤维化程度积分明显高于N组，差异有统计学意义(P<0.05)；与PQ组比较，L组大鼠第7d、21d肺纤维化程度积分减低，差异具有统计学意义(P<0.05)(表1)。

图3 肺组织masson染色(×200)

2.5 肺组织匀浆Ang II测定结果 PQ组及L组大鼠肺组织匀浆中Ang II含量随时间延长逐渐升高，各时间点均明显高于N组，差异均有统计学意义(P<0.05)。但L组大鼠肺组织匀浆AngII含量较 PQ组降低，各时间点的差异均有统计学意义(P<0.05)(表2)。

2.6 肺组织匀浆Ang-(1-7)测定结果 N组大鼠肺组织匀浆中Ang-(1-7)含量随时间延长无明显变化，各时间点的差异无统计学意义(P>0.05)。PQ组及L组大鼠中毒后第3d肺组织匀浆中Ang-(1-7)的含量低于N组，第7d、21d较N组明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。L组大鼠各时间点肺组织匀浆中Ang-(1-7)的含量明显高于PQ组，差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。

表1 3组大鼠肺泡炎及肺纤维化程度分级积分比较(±s，n=6)

表2 3组大鼠肺组织匀浆Ang II及Ang-(1-7)含量比较(pg/mL，±s，n=6)

2.7 肺组织ACE2的表达PQ组及L组大鼠ACE2蛋白在第3d、7d表达较N组弱，第21d表达较N组明显增高 (P<0.05)。L组大鼠各时间点ACE2蛋白的表达均较PQ组高，差异具有统计学意义(P<0.05) (图4，表3)。

图4 3组大鼠肺组织中ACE2蛋白的表达(×200)

2.8 肺组织Mas受体的表达PQ组及L组大鼠Mas受体在第3d、7d表达较N组弱，第21d表达较N组明显增高 (P<0.05)；L组大鼠各时间点Mas受体的表达均较PQ组高 (P<0.05)(图5，表3)。

图5 3组大鼠肺组织中MAS受体蛋白表达(×200倍)

组别Mas受体ACE23d7d21d3d7d21dN组0.481士0.0240.482士0.0250.482士0.0230.318士0.0110.318士0.0150.313士0.017PQ组0.159士0.018▲0.297士0.027▲0.576士0.008▲0.079士0.018▲0.185士0.012▲0.372士0.018▲L组0.225士0.025▲★0.391士0.032▲★0.761士0.117▲★0.123士0.016▲★0.235士0.017▲★0.468士0.053▲★F值346.24464.54425.235410.549126.35132.231P值<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05 注:与同时间点N组比较,▲P<0.05;与同时间点PQ组比较,★P<0.05

3 讨 论

肺是PQ作用的主要靶器官，张卓一等在PQ致肺损伤的动物实验中发现PQ中毒后1-3天主要表现为肺泡炎、肺水肿、肺出血；7-14天肺泡炎症减轻，局部胶原纤维增生，21天后出现弥漫性肺纤维化[5,6]。本实验中，PQ中毒所致大鼠行为学、病理改变与博来霉素致大鼠肺纤维化模型的肺损伤发展过程[7]及张卓一等的动物实验研究结果基本一致，且病理染色显示肺泡炎评分及肺纤维化程度积分均明显高于N组，提示百草枯中毒模型建立成功。L组大鼠使用氯沙坦灌胃干预后中毒症状较PQ组大鼠减轻，肺泡炎及肺纤维化程度积分均较PQ组大鼠明显减轻，提示氯沙坦可在一定程度上减轻百草枯中毒肺损伤及肺纤维化的形成。

微计算机断层扫描技术(Microcomputedtomography，MicroCT)又称微型CT、显微CT，是一种非破坏性的3D成像技术，可在不破坏样本的情况下清楚显示样本的内部显微结构。研究发现，肺泡炎与肺纤维化的病理变化发展与影像学改变存在一致性[8]，较多实验证实MicroCT可用于肺纤维化的动态观察[9,10]。本实验采用MicroCT对PQ中毒大鼠观察肺组织影像学变化。结果显示中毒后大鼠出现不同程度的肺纤维化表现，肺纤维化早期主要表现为双肺实变影，磨玻璃影，而结节影、胸膜下间质增厚及蜂窝状肺主要出现在中毒后期。证实了MicroCT可用于肺纤维化的无创诊断。

经典RAS成员主要包括ACE、AngII及AT1R，起调节血压、水盐平衡及参与局部组织生长、分化的作用，并且与组织器官的纤维化有关[3]。AngII是RAS主要的效应物质，作用于AT1R发挥其生物学作用。ACE2/Ang-(l-7)/Mas受体轴是近年来发现的RAS的新成员，发挥负向调节ACE/AngII/AT1R轴的作用，如降低血压、松弛平滑肌、抑制细胞肥大及纤维化形成。

近年发现，肺损伤及肺纤维化的发生发展与肺脏局部的RAS激活有密切关系。在IPF患者肺组织及PQ中毒致肺纤维化大鼠肺组织中均发现AngII表达明显增多[11,12]。本实验也发现，PQ中毒大鼠肺组织匀浆中AngII含量增加，且随中毒时间延长，PQ组大鼠肺纤维化程度逐渐加重，大鼠肺组织中AngII的表达逐渐增多，明显高于N组。向气管内滴入ACE2拮抗剂DX600或使用ACE2特定的小干扰RNA后比单纯使用博来霉素诱导的肺纤维化胶原沉积更明显，且肺组织中AngII含量增高更明显，而微泵注入纯化的人重组ACE2后可减轻博来霉素导致的肺内胶原沉积，ACE2可通过限制肺内AngII的聚集而抑制肺纤维化的形成[11]。对各组大鼠肺组织中ACE2/Ang-(l-7)/Mas受体轴各组成部分的检测发现，肺组织匀浆液中Ang-(l-7)的含量在PQ中毒大鼠第3d时明显低于N组，但随时间延长逐渐升高，7d后明显高于N组，而ACE2及Mas受体的免疫组化检测结果显示，在实验第3d及第7d两个时间点，PQ中毒大鼠肺组织中的表达量低于N组，而第21d高于N组，与王晓萍等[12]在PQ中毒大鼠实验中观察到的ACE2mRNA表达的变化趋势基本一致。该结果提示ACE/AngII/AT1R轴参与了肺损伤及肺纤维化的发生发展过程。而在大鼠PQ中毒早期，肺内ACE2/Ang-(l-7)/Mas受体轴受到抑制，而随时间延长，肺内ACE2/Ang-(l-7)/Mas受体轴逐渐被激活，由此结果可得出，上调ACE2/Ang-(l-7)/Mas受体轴的表达或抑制经典RAS的表达有可能成为临床治疗PQ中毒肺损伤及肺纤维化的靶点。

氯沙坦是一种血管紧张素II1型受体(AT1R)拮抗剂，目前主要作为抗高血压药物，在肺纤维化的治疗中使用较少。实验表明，在给予IPF患者氯沙坦治疗12个月后，患者的肺功能较未治疗组患者明显好转[13]。韩素霞等[14]在烟草烟雾诱导的大鼠肺动脉高压模型中观察到氯沙坦可下调肺组织中AngII的表达，促进ACE2蛋白的表达，从而改善肺动脉高压病程中肺小动脉的重构。本研究发现，PQ中毒大鼠接受氯沙坦灌胃治疗后，肺组织中ACE2/Ang-(l-7)/Mas受体轴的表达较未接受氯沙坦治疗的PQ中毒组增高，而肺组织中AngII表达明显受到抑制。以上结果说明，氯沙坦可能通过抑制经典RAS轴并上调ACE2/Ang-(l-7)/Mas受体轴的表达，从而减轻百草枯中毒肺损伤及肺纤维化的形成，为其临床应用提供实验依据。