2009-2017年江苏省手足口病病原谱及柯萨奇A16型的分子流行病学研究

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手足口病(Hand, foot and mouth disease，HFMD)是一种由多种肠道病毒引起的急性传染病，多发于5岁以下儿童[1-3]。大多数患者以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要特征，病程5～7 d，一般预后良好，但少数重症患者可迅速出现中枢神经系统、呼吸系统及心血管系统等全身并发症，如脑炎、脑膜炎、急性弛缓性麻痹、肺水肿和心肌炎等，该类患者病情进展快，易发生死亡。手足口病传染性强，传播机制容易实现，托幼机构等集体单位由于易感者集中，容易发生聚集性和暴发疫情[4-5]，处置不当可在短时间内造成较大规模的暴发流行。自2009年至2017年全国累计报告HFMD 17 694 904例，重症病例数149 227例，死亡3 506人，发病数居法定传染病首位。HFMD在我国的流行造成了严重的经济和社会负担，给公共卫生机构带来巨大的挑战。

在我国，手足口病基本上是由肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CVA16)引起为主[6-8]，HFMD重症和死亡病例的病原构成以EV7l占绝对优势。CVA16引起的手足口病症状较轻，较少有并发症发生。但近年来，几起比较严重的手足口疫情均是由EV71和CVA16的共同循环导致[9-10]，EV71和CVA16混合感染亦有报道[11-12]，而疫情监控和疫苗研发则主要集中于EV71。此外，我国自主研制的EV71灭活疫苗已于2015年12月获批上市， EV71灭活疫苗的广泛接种可能会使流行毒株从EV71向CVA16或其他肠道病毒转移。本研究对2009-2017年江苏省手足口病病原谱进行调查，并对CVA16 VP1 基因进行进化分析，以明确江苏省手足口病的病原谱流行情况及CVA16的分子流行病学特征。通过对疫苗使用前后江苏省CVA16的流行趋势和病原学变迁进行连续监测，为本省HFMD的有效防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1资料和标本来源 手足口病病例资料来源于“中国疾病预防控制信息系统”，收集2009-2017年江苏省手足口病报告病例个案、人口学信息(性别和出生日期)、病原学结果(EV71、CVA16、其他肠道病毒)、病例类型(临床诊断病例、实验室诊断病例、重症病例)等信息，其中CAV16病例为发病日期在2009-2017年间实验室结果为CVA16核酸检测阳性的HMFD病例。标本来源于2009-2017年江苏省13个地级市按照江苏省手足口病监测工作方案要求上送至江苏省疾病预防控制中心的CVA16核酸检测阳性标本(咽拭子或肛拭子)。

1.1.2病例定义 临床诊断病例是发热伴手、足、口、臀部皮疹，部分病例可无发热。临床诊断病例符合下列条件之一，即为实验室诊断病例：特异性RNA检测阳性、病毒分离阳性或急性期与恢复期血清中和抗体有4倍或4倍以上的升高。重症病例是出现神经系统受累、呼吸及循环功能障碍等表现，实验室检查可有外周血白细胞增高、脑脊液异常、血糖增高，脑电图、脑脊髓磁共振、胸部X线、超声心动图检查异常[13]。

1.1.3仪器与试剂 全自动核酸提取仪MagNA Pure LC及配套试剂购自Roche公司，QIAxcel毛细管电泳仪及配套试剂购自QIAGEN公司，OneStep RT-PCR Kit购自QIAGEN公司，胎牛血清、青霉素和Opti-MEM培养液购自GIBCO公司。

1.2 方法

1.2.1病毒分离 将核酸检测结果为CVA16阳性的标本接种于人横纹肌肉瘤(RD)细胞，采用含2%胎牛血清、100 U/mL青霉素的Opti-MEM培养液于37 ℃、5%CO2条件下培养5～7 d，每日观察细胞病变(cytopathic effect，CPE)，盲传两代，若出现细胞病变，收获培养上清液，并储存于-80 ℃。

1.2.2核酸提取 按照Roche公司MagNA Pure LC全自动核酸提取仪和MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit的操作说明，提取上述毒株核酸并放置于-80 ℃保存。

1.2.3CVA16 VP1基因扩增和测序 采用One-step RT-PCR Kit对CVA16分离株VPl基因进行扩增，并设置阴性对照。扩增引物序列分别为： CVA16-VP1-F: 5′-AGGTACTACACCCAGTGGTCAG-3′(2 030-2 052 nt), 和 CVA-VP1-R: 5′-GCAAGGTGCCGATTCACTACCCT-3′(3 400～3 423 nt)。PCR反应条件为：50 ℃逆转录30 min, 95 ℃变性15 min, 95 ℃，30 s, 52 ℃，45 s, 72 ℃，90 s,35个循环，72 ℃延伸10 min。上述扩增产物采用QIAxcel毛细管电泳仪检测验证后送上海生工生物技术有限公司进行测序。

1.2.4生物信息学分析 采用DNAStar软件对测序获得的CVA16 VP1序列进行核苷酸和氨基酸序列分析及同源性比较，构建系统发生树采用Mega 5.0软件的最大似然法(Maximum Likelihood)。

1.2.5统计学分析 采用Excel 2007软件进行数据整理，利用SPSS17.0软件进行数据分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1发病概况 2009-2017年江苏省共报告手足口临床诊断病例1 013 771例，报告年均发病率为142.86/10万(1 013 771/ 709 615 095)，发病率最高为2014年的210.52 /10万，最低为2009年的109.35/10万；其中,重症9 379例，年均重症百分比为0.93%(9 379/ 1 013 771)；重症百分比最高为2011年的1.78%，最低为2009年和2016年的0.42%，年重症百分比呈下降趋势。报告病例中男性构成比59.27%～62.24%。自手足口病成为法定报告传染病以来，病例报告和监测不断完善和改进，江苏省手足口病报告趋于稳定，2012年后出现偶数年份较奇数年份高发的特点，见表1。

2.2病原学检测 2009-2017年江苏省共检测出手足口病肠道病毒(EV)阳性病例37 389例。除2009年，其他年份每年检出的肠道病毒阳性病例均在3 600份以上，其中，EV71占39.85% (14 898/39 389)， CVA16占30.13%(11 265/37 389)，其他肠道病毒占28.88%(10 798/37 389)。2009-2017年，EV71在肠道病毒阳性病例中的年度构成比分别为45.14%、49.55%、50.66%、40.72%、35.96%、39.72%、15.03%、29.51%和47.26%，而CVA16在肠道病毒阳性病例中的年度构成比分别为40.34%、31.26%、29.15%、41.05%、11.97%、34.82%、29.46%、30.79%和21.34%，因此EV71和CVA16为占据主导地位的两种血清型，如图1所示。重症病例中，主要以EV71血清型为主，在2009-2017年的重症病例中，EV71的年度构成比分别为85.49%、80.45%、80.06%、79.80%、67.74%、83.99%、94.72%、67.70%、86.18%，而CVA16的年度构成比分别仅为4.15%、3.76%、8.16%、12.23%、1.34%、5.28%、0.77%、7.80%、3.92%，如图2所示。

图1 2009-2017年江苏省手足口病病原构成及肠道病毒阳性病例数Fig.1 Enterovirus positive HFMD cases and distribution of enterovirus strains in Jiangsu province, 2009-2017

图2 2009-2017年江苏省手足口病重症病原构成及重症病例数Fig.2 Enterovirus-associated severe HFMD cases and distribution of severe enterovirus strains in Jiangsu province, 2009-2017

2.3 CVA16流行病学特征

2.3.1人群分布 如图3所示，2009-2017年江苏省CVA16高发年龄段主要集中在6月龄～5岁，尤其是12-23月龄，小于6月龄，大于5岁和成年人发病率低。CVA16感染病例中男性构成比介于55.97%～66.97%，其病例数年龄和性别分布与总体HFMD人群分布相近。

图3 2009-2017年江苏省CVA16发病年龄分布Fig.3 Age distribution of CVA16 cases in Jiangsu province, 2009-2017

2.3.2时间分布 如图4所示，CVA16发病时间主要呈一主峰一次峰的双峰流行，2009-2011年主峰发生在3-6月份，2012-2017年主峰发生在3-7月份；2010、2016和2017年无明显次峰，其余年份次峰发生在9-11月，次峰远低于主峰。

图4 2009-2017年江苏省CVA16发病时间分布Fig.4 Distribution of CVA16 infection in Jiangsu province, 2009-2017

2.4VP1基因核苷酸及编码氨基酸序列分析 对2009-2017年江苏省104株CVA16型轻症病例，16株CVA16重症病例分离株进行VP1基因核苷酸序列测定和分析。CVA16毒株VP1基因核苷酸序列长度为891 bp, 编码297个氨基酸。120株CVA16毒株VP1序列提交到NCBI数据库，104株CVA16轻症GenBank登录号为MH516915-MH517015, 16株CVA16重症GenBank登录号为：MH491122-MH491129, MH491131-MH491134和MA491136-491139。利用DNAStarMegAlign软件进行VP1基因核苷酸和氨基酸序列比对分析。120株CVA16毒株的核苷酸与氨基酸序列同源性分别为 87.5%～100%、 97%～100%。120株毒株的VP1基因与A基因型、B基因型各亚型B1a和B1b以及B2基因型VP1区核苷酸和氨基酸同源性比较结果见表2。

表2 江苏省CVA16分离株与CVA16不同基因性及亚型代表株VP1核苷酸与氨基酸同源性比较Tab.2 Homology comparison of nucleotide sequence and amino acid sequence among CVA16 strains from Jiangsu province and reference genotype (subgenotype) CVA16 strains based on VP1 genes

2.5江苏省CVA16分离株VP1区编码蛋白变异位点分析 将VP1完整编码区翻译成氨基酸序列进行分析，发现2009-2017年江苏省的120株CVA16氨基酸序列的第23位点是氨基酸变异的频繁区域，65株CVA16分离株发生了L→M的突变,其次是第218位点，7株CVA16分离株发生了N→G的突变。上述突变在轻症和重症病例中呈现无规律散在分布。

2.6CVA16分离株VP1基因进化分析 选取从GenBank下载的45条国内其他省(市)和其他国家或地区有代表型的CVA16 VP1全长序列，分别来自美国、马来西亚、美国、越南、日本、泰国和中国台湾等国家或地区以及我国大陆的山东、河南、湖南、广东、浙江等省(市)[14-16]，与2009-2017年江苏省的120条CVA16 VP1序列进行遗传进化分析，并构建系统进化树。结果表明，2009-2017年120株CVA16江苏分离株与B1a和B1b亚型代表株分别处于同一分支上(见图5)，与原型株G-10及国外地区分离株的遗传距离较远，与国内地区(如河南、山东、浙江等省份)分离株的遗传距离近，亲缘关系近。120株CVA16江苏分离株相互之间的遗传距离较近，亲缘关系近。同时，进化树显示，江苏省分离株在年度和各个地区分布上交错分布，无明显聚集性，轻症和重症的毒株未在进化树上呈现规律分布。

A:CVA16分离株VP1区进化树分析； B:部分CVA16分离株VP1区进化树分析 ▲：轻症 CVA16 分离株；●: 重症 CVA16 分离株

3 讨 论

本研究系统描述2009-2017年连续9年间江苏省HFMD的发病情况和CVA16的病原学监测结果，为HFMD防控策略的制定及EV71疫苗上市后CVA16的流行趋势和病原学变迁提供了详细的流行病学数据。

江苏省是我国手足口病的流行区，2009-2012年江苏省手足口病报告病例持续上升，2013年有所回落，之后呈现偶数年高发奇数年低发的流行特征，年均发病率为142.86/10万，年发病率总体呈上升趋势。而重症病例数自2015年后明显下降，这可能与2016年EV71疫苗上市有关。

病原学监测数据显示，江苏省2009-2017年手足口病主要由EV71和CVA16引起，同时每年均伴随其他肠道病毒的感染。EV71感染率呈现下降趋势，但2017年有所回升；CVA16总体感染率呈下降趋势，其他肠道病毒感染率逐步上升。重症病例中，年重症百分比成下降趋势，2009-2016年间每两年出现一次重症高峰，但2017年的高峰并不明显，这可能与人们对手足口病的重视以及EV71疫苗上市有关。病原方面重症病例仍然以EV71为主要病原， CVA16及其他肠道病毒引起的重症病例较少。而在2012年，CVA16引起的重症病例数明显增加，占12.23%，这可能与2012年EV71流行强度较小，而CVA16流行强度较高有关。之后CVA16引起的重症病例数有所回落，2015年最低，为0.77%。2016年CVA16引起的重症病例数再次增加。

对2009-2017年江苏省CVA16感染病例进行流行病学特点和病原学特点进行描述分析，其病例数年龄分布与总体HFMD年龄分布相近。CVA16易感人群是6个月～5岁婴幼儿，尤其1～4岁组CVA16感染最高，与其他研究报道相似[17-18]，这可能与低年龄组免疫水平低下有关[19]。CVA16感染人群男性多于女性，这可能是男孩喜爱活动，更多暴露在病毒环境中有关。

CVA16各年发病呈现两个季节性高峰，2009-2011年主峰发生在3-6月份，2012-2017年主峰发生在3-7月；2010、2016和2017年无明显次峰，其余年份次峰发生在9-11月，次峰远低于主峰。CVA16的时间分布特征与其它病原相似，但发病高峰时间较EV71 和其他肠道病毒提前一个月。由于3-6月气温逐渐回暖，降雨多，湿度大，有利于手足口病毒繁殖生存，易出现高发。随着8月暑期放假，幼儿减少了在托幼机构密切接触机会，发病曲线出现明显回落。9月开学，学生返校，再次增加了接触传播的机会。12月至2月为全年最低气温期，发病率大幅降低。

对江苏省120株CVA16型分离株进行VP1基因核苷酸测定和分析，该120株CVA16毒株的VP1基因核苷酸与氨基酸序列同源性分别为87.5%～100%和 97%～100%。与A基因型和B基因型各亚型B1a、B1b以及B2株VP1区核苷酸同源性分别为74.1%～77.1%、88.3%～98.7%、88.1%～98.4%和87.1%～91.1%；氨基酸同源性分别为89.2%～92.3%、97.3%～100%、96.3%～100%和98.3%～100%。根据以上核苷酸和氨基酸序列同源性分析结果可知，CVA16分离株核苷酸序列变异较大，但氨基酸同源性较高，推断存在一定的同义突变。对CVA16分离株VP1区氨基酸序列变异位点分析发现，第23位氨基酸位点为变异频繁区域，有65株CVA16分离株发生了L→M的突变，其次是第218位点，有7株CVA16分离株发生了N→G的突变。上述突变在轻症和重症病例中呈现无规律散在分布，提示上述突变位点与CVA16引起的临床差异无关。

2009-2017年120株CVA16江苏省分离毒株与原型株G-10株及国外地区分离株遗传距离较远，亲缘关系远，与国内地区分离株的遗传距离近，亲缘关系近。提示江苏省CVA16分离株在进化上并不是独立的，而是与国内地区的CVA16同进化共循环的。VP1基因序列的进化分析显示，引起江苏省HFMD的120株CVA16分属于B1a亚型和B1b亚型，其中B1b亚型为优势流行基因亚型。推测进化树上这两簇的形成可能与其进化来源有关。轻症,重症在进化树上无规律散在分布，提示CVA16引起的临床差异可能与VP1区的基因序列无关。

本研究通过对2009-2017年江苏省HFMD流行情况和CVA16的分子流行病学特征及其基因特征进行分析。对疫苗使用前后江苏省CVA16的流行趋势和病原学变迁进行连续监测，为本省HFMD的有效防控提供基础资料。

利益冲突：无