人结膜吸吮线虫病2例报告及Cox1基因分析

， ， ，，安春

吸吮线虫病(Thelaziosis)是由吸吮线虫引起的一种人兽共患线虫病。狗、猫、牛等家畜和野生哺乳动物为其适宜宿主，人体也可偶而被感染[1]。吸吮线虫种类繁多，目前已经确定的至少有30多种。以往报道能人体引起人体感染的吸吮线虫有两种，即结膜吸吮线虫(T.callipaeda)和加里福尼亚吸吮线虫(T.californiensis)。2018年，Bradbury在美国发现了可引起人体感染的第3种吸吮线虫，即大口吸吮线虫(T.gulosa)，也称牛眼虫(the cattle eyeworm)[2]。吸吮线虫呈世界性散在分布。中国、日本、印度、缅甸、韩国、中国台湾、泰国、印度尼西亚、俄罗斯，意大利和法国等均有人体病例报道。不同种吸吮线虫不仅有形态差异，而且地域分布也有不同[3-4]。结膜吸吮线虫主要分布于中国、韩国及印度等东南亚国家和地区[5-7]，故又被称为东方眼虫。此外，在意大利、罗马尼亚及英国等欧洲也有结膜吸吮线虫病例报道[8-10]。加里福尼亚吸吮线虫见于美国西部[11]，大口吸吮线虫仅发现于北美[2]。中国是吸吮线虫病报道最多的国家，自1917年首先在北京和福建报道结膜吸吮线虫人体病例以来，各地陆续报道，至2016年底，报告病例数已达626例[12]。此前的病例报告主要依据形态学特征或临床症状进行诊断。本课题组曾报道了用Cox1基因鉴定的人结膜吸吮线虫病[5,13-14]。本文对分别新发现于辽宁和山东的2例感染者分离到的虫体进行了形态学观察、Cox1基因鉴定、测序及序列分析，对两地分离株系统进化树进行了分析探讨。

1 材料和方法

1.1虫体来源 虫体1来自中国医科大学附属第一医院眼科门诊就诊患者，虫体2源于山东省寄生虫病研究所就诊患者。两条虫体均由眼科医生取出，生理盐水保存。并分别经患者知情，并通过所在医院伦理委员会批准进行虫体鉴定。

1.2形态学鉴定 将虫体置于含生理盐水的平皿中，用解剖显微镜观察虫体的大体形态。再行盐酸卡红染色，显微镜下观察微细结构。之后将虫体于75%乙醇溶液4 ℃保存。

1.3 基因鉴定

1.3.1DNA提取 从保存液中取出虫体，于匀浆器中研磨，然后用SDS/蛋白激酶K消化，常规酚氯仿法提取基因组DNA，加入TE缓冲液，-20 ℃保存。

1.3.2PCR扩增 查阅文献，上游引物：NTF：5′-TGATTGGTGGTTTTGGTAA-3′，下游引物：NTR：5′-ATAAGTACGAGTATCAATATC-3′。PCR反应体系(50 μL)：DNA 模板2 μL，Premix25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，并加水至50 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸5 min。灭菌ddH2O作空白对照。

1.3.3样品测序 取5 μL扩增产物在2%琼脂糖凝胶中电泳确定为目的基因，余45 μL产物送北京华大公司进行基因测序。

1.3.4DNA序列比对 采用Contig Express软件对双向测序获得的两对序列进行拼接，然后经DNAStar软件进行人工校正，在NCBI上进行同源性比较；使用MEGA7软件与获得目标序列进行完全比对,以邻接法(neighbor-joining method,NJ)绘制种系发育树，Bootstrap置信值重复抽样1000次。

2 结 果

2.1形态学鉴定结果 显微镜观察虫体外观细长呈线状、乳白色、半透明，成虫头端及尾端圆钝，虫体表面具有明显的锯齿状横纹，前端有一典型的六角形梯状口腔(图1),雌虫尾端较钝，雄虫尾端较尖且由泄殖腔内伸出向腹面弯曲的长短交合刺各1根。根据形态学特征，对比和参照文献，认定虫体1(11 mm×0.4 mm)为结膜吸吮线虫雌虫、虫体2(12 mm×0.5 mm)为结膜吸吮线虫雄虫。

图1 虫体的头部，显示六角形口囊(盐酸卡红染色)(40×)Fig.1 Head and the hexagonal mouth stained by hydrochloric acid-armine(40×)

图2 琼脂糖凝胶电泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis

2.2基因鉴定结果 2例虫体经Cox1基因扩增均得到689 bp目的片段(图2)，双向测通，BLAST同源性分析的结果显示与结膜吸吮线虫线粒体全基因组的一致性 (Similarity Index)均为99%。DNAStar软件分析2例标本一致性为98.3%，8个碱基突变位点(G/A位于221、236、467、473、608；C/T位于225、401、539)。11个不同地理分布株一致性为98%～100%。

2.3Cox1基因系统进化树分析Cox1基因系统进化树分析如图3所示，比较结果表明，辽宁人源结膜吸吮线虫与意大利犬源(AM042555.1)属于同一分支,与欧洲株同源,且2例标本一致性为99.1%，6个碱基突变位点(G/T位于8；G/A位于311、468；C/T位于39、47、401)；山东人源结膜吸吮线虫与罗马尼亚犬源(KP087796.1)、斯洛伐克犬源(KY476400.1)、匈牙利猫源(KX372681.1)及塞尔维亚猫源(KJ433983.1)属于同一大分支，亦与欧洲株同源,一致性为99.6%,3个碱基突变位点(G/T位于8；G/A位于221、257)。

图3 Cox1基因系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of Cox1 gene

3 讨 论

采用DNA序列分析仍然是鉴定结膜吸吮线虫虫种、亚种、株和遗传变异最可靠的方法[15]。线粒体基因由于其母系遗传、DNA进化速率快且不发生重组，可作为分子标记用于生物分子种群遗传学的研究[16-17]。在寄生虫的分类鉴定和群体遗传方面，Cox1基因的插入和缺失较少，长度及进化速度适中，常被用作物种种群遗传和系统进化的研究[18]。但目前结膜吸吮线虫的线粒体基因组信息报道较少，仅见Liu[19]等报道的中国广东省犬源结膜吸吮线虫的线粒体基因组特征：全长13 668 bp,富含AT碱基(74.6%),包含12个蛋白编码基因、22个转运RNA基因、2个核糖体RNA基因和1个非编码区，并缺乏1个atp8基因。首次阐明我国犬源结膜吸吮线虫线粒体基因组，该基因组为研究寄生虫的流行病学、生态学、群体遗传学提供了新的遗传标记。Otranto[20]等采集自中国、韩国、意大利和德国的动物源结膜吸吮线虫，对Cox1基因进行测序和基因突变扫描，发现50个成虫标本有8种不同的基因变异序列。在已经发表的GenBank数据库中，有关结膜吸吮线虫Cox1基因序列仅有15条，按地区来源选取9条序列。

迄今的流行病学资料表明，结膜吸吮线虫主要分布于中国、韩国及印度等东南亚国家和地区[5-7],加里福尼亚吸吮线虫见于美国西部[11]，大口吸吮线虫仅发现于北美[2]。中国是吸吮线虫病高发的地区，迄今见文献报道的600多宗人体病例基本是依据虫体的形态学或临床表现等诊断为结膜吸吮线虫,尚缺乏可靠的分子水平的证据,也无法区分不同种、株间由于受自然、地理等环境因素长期影响产生的遗传分化程度。中国境内是否存在其它吸吮线虫虫种感染人体或动物有待于进一步证明。本课题组曾报道了用Cox1基因鉴定的人源结膜吸吮线虫[5,13-14]。本文对新分别发现于辽宁和山东的2例感染者分离到的虫体进行了形态学观察，在初步证明是吸吮线虫的基础上，进行了Cox1基因鉴定、测序及序列分析，从基因水平证明两地人源虫体均属于结膜吸吮线虫。将测得的辽宁和山东两省人源结膜吸吮线虫Cox1基因序列进行比对、构建了系统进化树，分析结果显示辽宁结膜吸吮线虫与意大利犬源(AM042555.1)属于同一分支，山东结膜吸吮线虫与罗马尼亚犬源(KP087796.1)、斯洛伐克犬源(KY476400.1)、匈牙利猫源(KX372681.1)及塞尔维亚猫源(KJ433983.1)属于同一大分支，说明二者均与欧洲株同源。本研究证明了我国人体感染的结膜吸吮线虫与我国犬感染的虫种以及欧洲源虫体基因的同源性，且虫株之间未见明显遗传变异现象(98%～100%)。

本研究通过检测获得辽宁和山东两地人感染的结膜吸吮线虫Cox1基因，验证了Cox1基因可以作为结膜吸吮线虫的分子诊断标记，进一步丰富了有关结膜吸吮线虫基因序列的基础资料。但由于目前结膜吸吮线虫基因信息相对匮乏，构建发育树的参考序列有限，使得我国结膜吸吮线虫的分子分类鉴定和群体遗传变异研究方面尚需更多工作要做。

利益冲突：无