一种改良的布鲁氏菌病抗体微量凝集检测方法的建立与评价

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布鲁氏菌病(Brucellosis)由布鲁菌(Brucella)侵入机体引起的一种以发热为特征的人兽共患慢性传染变态反应性疾病。该病在世界范围内广泛流行，每年新发病例超过50万例[1]，在我国近20年持续高发，是对人类健康和畜牧业发展危害最严重的一种传染病[2]。布鲁氏菌病的诊断技术包括血清学检测技术和病原学检测技术。细菌学检测虽是诊断布鲁菌病的金标准，但存在培养周期长、检出率低、实验室生物安全等问题。血清学检测布鲁氏菌抗体技术使用广泛、生物风险小、操作简便，是现阶段最常用的技术。目前我国实行的 WS269-2007《布鲁氏菌病诊断标准》中适用的血清学检测技术有虎红平板凝集试验(RBPT)、标准试管凝集试验 (SAT)、补体结合试验(CFT)等。但血清学检测技术的敏感性和特异性，不同的研究方法有不同的结果[3-4]。SAT虽然是确诊布病的标准检测方法，但需要大量的试管凝集抗原和患者血清，尤其在流行病学调查中，对大量标本进行检测时费时费力。微量凝集试验是对试管凝集试验的改良，具有微量、简便、稳定性和特异性好的特点。本研究建立一种可显色的布鲁氏菌病抗体微量凝集检测方法(Microagglutination Test, MAT)，可在96孔V型板上同时检测24份标本，且结果易判读，更适宜基层防疫人员现场检测，最终为疫情处置提供强有力的技术支持。

1 材料与方法

1.1确诊病例定义 根据我国《布鲁氏菌病诊断标准》(WS269-2007)：流行病学接触史、临床症状和 RBPT法阳性以及 SAT滴度为1∶100(++)及以上，满足以上3项条件者确诊为布病病人。

1.2主要试剂 布鲁氏菌病RBPT抗原和SAT抗原由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所提供。

1.3显色微量凝集抗原制备 取常规试管法抗原用虎红染料染色，然后用生理盐水分别稀释成1∶5、1∶10、1∶20备用。

1.4标准阳性血清效价测定 采用SAT按我国《布鲁氏菌病诊断标准》(WS269-2007)方法操作，用标准阴性血清对照进行标准阳性血清标定，其结果应为1∶400。

1.5显色微量凝集抗原最佳浓度的优化 用33份布病病人阳性血清、1份标准阳性血清和1份阴性

血清按照常规SAT法，每份血清样品分别加入1∶5、1∶10和1∶20抗原，混匀，加盖，放入湿盒，置37 ℃温箱，20 h取出，室温静置1 h观察结果。

1.6结果判读标准 常规SAT参照国标WS269-2007方法，以凝集程度为“++”为最终效价；微量SAT以V型管底不出现非常明显红点或极小红点为阳性。

1.7统计方法 试验结果使用Excel进行录入, 对全部结果应用SPSS 20.0统计软件进行分析。两种方法比较差异应用卡方检验，P>0.05表示两种方法差异无统计学意义。

2 结 果

2.1微量凝集试验 显色结果第1～8孔血清浓度分别为1∶50，1∶100，1∶200,1∶400,1∶800,1∶1 600,1∶3 200和……1∶6 400，MAT以V型管底不出现非常明显红点或极小红点为阳性，部分结果见下图1。20和64为阴性结果；29、4、12、88、89和66为阳性结果(图中用“+”表示)，效价分别为1∶800、1∶400、1∶400、1∶200、1∶800和1∶100。

图1 微量凝集试验显色结果Fig.1 Results of MAT(the part of samples)“+”means antibody positive titers

2.2抗原优化结果 用33份阳性血清和3份阴性血清进行测试，当微量凝集抗原浓度为1∶10时，与SAT结果最吻合，见表1。

表1 MAT试验抗原优化结果Tab.1 Optimization of MAT antigen

2.3SAT和MAT结果一致性比较结果 对142个血清样本同时做SAT和MAT，结果SAT检测得到21份阴性样本，22份可疑样本(1∶50)，99份阳性样本(>1∶100)。MAT检测得到30份阴性样本、17份可疑样本(1∶50)、95份阳性样本(>1∶100)。如图2所示，图中数字对应横纵坐标即为试验结果(例如MAT结果与SAT结果均为1∶200阳性的样品个数为12)这两种试验方法结果相同的占70.4%(100/142)，位于对角线方格内，结果相差1个滴度的占28.6%(40/142)，相差2个滴度的占1.4%(1/142)。两种试验方法相关系数为0.978。

注：此图类似于横纵坐标图，图中数据为样本数，对应的横纵坐标分别为该样本数对应的SAT结果与MAT结果，空格即代表样本数为0

2.4MAT评价指标分析结果 以SAT为参照标准，MAT敏感度和特异度分别为分别为98.9%和92.3%；和常规试管凝集法相比，两种方法符合率为96.5%。见表2。

表2 微量凝集试验效果评价Tab.2 Evaluation indicators of MAT

2.5MAT和SAT两种试验方法统计学检验结果 用配对χ2检验，χ2=0.8，P>0.05，两种方法不存在统计学差异，见表3。

表3 MAT与SAT两种方法检测血清阳性结果Tab.3 Statistical testing between MAT and SAT

3 讨 论

动物布鲁氏菌病诊断技术GB/T 18646-2018中，增加了试管凝集试验中的微量法，目的就是为现场检测人员提供一种操作简易，判读方便，成本低、通量高的一种免疫学检测方法。目前，人布鲁氏菌病诊断标准(WS269-2007)中还没有微量凝集法，也没有商品化的微量凝集抗原，本研究不仅可为临床及公共卫生部门诊断布病提供一种新方法，也可为今后修改人布鲁氏菌病诊断标准提供数据。

本研究优化了微量凝集试验抗原浓度，最终确定为1∶10为最适浓度，与国内外文献报道相符[5-8]。SAT和MAT两种方法经统计学检验差异无统计学意义，不符合的检验结果可能与操作误差及肉眼判读有关，还需大样本量的验证。此外，笔者还验证了不同血清量对结果的影响，10 μL血清可以保证结果准确可靠，节省了样本量。ELISA也可以对大样本量检测[6, 9-11]，笔者实验室目前也在对ELISA、SAT和MAT进行评价。

试验结果真实性的评价指标为灵敏度和特异度，灵敏度越高反映该试验发现病人的能力越强；特异度越高反映该试验确定非病人的能力越强。可靠性评价指标是符合率和Kappa值，这两个指标可以反映试验判定的结果与标准诊断结果的一致性[12]。ROC曲线是评价检验试验的一种全面、准确、有效的方法，曲线下面积反映了诊断试验价值的大小，面积越大，越接近1.0，诊断的真实度越高。由表2可以看出，本实验具有较高的灵敏度特异度符合率(接近100%)，Kappa值与ROC曲线下面积接近1，真实性可靠性较好。目前部分国外学者对该方法的研究结果与本实验室的研究结果相同，说明MAT可以替代现有的SAT。与SAT相比，MAT的优点在于：1)省时省力：在进行大量标本检测时，国家规定的试管凝集法显得费时费力，操作时需要反复刷洗试管和吸管，占用大量的试管架和温箱空间，且判定结果时需要一一对比，操作起来很不方便；2)准确性高：微量凝集试验使用精密的微量移液器，避免了使用吸管所产生的误差，使用一次性96孔V型板和吸头，避免了由于试管和吸管洗刷不干净产生的影响；3)成本低，结果易于判读：由于使用的抗原(50 μL)和待检血清(10 μL)都是微量，节省了标本和试剂，由于采用显色的抗原，结果判读一目了然；4)易于推广：微量凝集法检测所需的待检血清样品的量是试管法的1/10，因此采血量明显减少，工作量也会减少；一次可以同时检测24份标本，十分有利于兽医和人医在生产实践中的推广。

综上所述，本研究建立了较为准确、可靠的布鲁氏菌病微量凝集检测方法，发展了布病的快速检测技术，但因样本量较少，仍需后续研究重复验证，以期尽快应用于布病现场的快速检测。

利益冲突：无