猪血粉酶解液脱色工艺研究

西南大学动物科学学院 重庆 402460

目前，我国年出栏生猪约7亿头，是世界上猪出栏数最多的国家，由屠宰生猪而产生的副产物猪血大约有200万t，资源相当的丰富[1]。猪血的营养价值很高，素有“液态肉”之称。猪血中含有大量的蛋白质和丰富的氨基酸，包括人体所必需的8种氨基酸在内的18种氨基酸，特别是赖氨酸、亮氨酸含量丰富。此外，还含有适量矿物质、维生素、激素、酶和其它一些生物活性物质[2]。

在血液中的血细胞以红细胞为主，红细胞的蛋白质含量达38%，占全血蛋白总量的75%以上。红细胞经溶血后可得血红蛋白，血红蛋白再酶解成血红蛋白多肽和氨基酸，血红蛋白多肽比血红蛋白具有更优良的营养特性、生理特性和加工特性，更容易被人体消化吸收，在食品工业中被广泛应用[3]。但是在酶解过程中往往伴随大量色素物质形成，释放出大量血红素，释放的血红素因具有疏水性而聚合成微粒，并被氧化成氧化血红素，使生成的氨基酸和血红蛋白多肽混合物液呈现出深褐色乃至黑褐色，这会干扰氨基酸、肽的分析，同时影响产品的纯度和色泽，使其在实际应用中受到限制[4]。因此，在制备血液制品过程中必须将色素除去。

本文以猪血粉酶解液为研究对象，主要研究了粉末活性炭用量、pH值、脱色温度和脱色时间对猪血粉酶解液脱色效果的影响,得到了其最佳酶解工艺参数，以期为猪血多肽制品的工业化生产提供技术参数和有益参考。

1 材料与方法

1.1 原辅料

猪血粉,天津恩彼生物工程有限公司；2709碱性蛋白酶,广西南宁庞博生物科技有限公司20万u；粉末活性炭,上海生化试剂厂；氢氧化钠、盐酸等常规试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器设备

BS200S—WE1电子天平(北京塞多利斯仪器有限公司)；H．H．S21．4电热恒温水浴锅(江苏常熟医疗器械厂)；78HW-1型恒温磁力搅拌器(江苏省金坛市恒丰仪器厂)；756型紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)；LD-5离心机(北京医用离心机有限公司)；HB-IIIA型循环水式多用真空泵(宁波东胜仪器科技有限公司)；凯氏定氮装置等。

1.3 测试指标

1.3.1 脱色率[5]

用紫外分光光度计在色素的最大吸收波长处测定其吸光度值(OD)。猪血粉酶解液的最大吸收波长为398nm，故选398nm为测定波长。

OD1—脱色前的OD398，OD2—脱色后的OD398。

1.3.2 氮损失率[6]

用凯氏定氮法测定脱色前后酶解液的含氮量。

W1—脱色前含氮量，W2—脱色后含氮量。

1.4 试验方法

1.4.1 工艺流程

猪血粉→酶解→离心→上清液→活性炭脱色→抽滤→脱色液→测定。

1.4.2 酶解

将猪血粉加水溶解，根据酶解底物浓度取样，搅拌均匀，调节恒温水浴锅至所需温度，加入适量的2709碱性蛋白酶，用6mo1/L的NaOH调节酶解液至最适pH。酶解过程中用搅拌器连续搅拌，并不断加入6mo1/L NaOH，以维持pH值的变化在规定的±0.05的范围内，酶解完成后，用6mo1/L HCl调节溶液pH值至4.5，并升温至90℃维持20min，对酶进行灭活，以终止反应，然后迅速冷却至室温，置于离心机中，在4 000r/min下离心20min，倒出上清液，记录总体积。酶解条件：底物浓度4.0%、pH 10.5、温度45℃、酶浓度4 000U/g、酶解时间6h[7]。

1.4.3 脱色

将离心后的上清液用粉末活性炭进行脱色处理，即用离心机以4 000r/min的转速离心20min，收集上清液。取100mL上清液，加入活性炭，调节溶液pH值，在一定的温度下进行脱色，脱色过程中用搅拌器不断搅拌，让活性炭均匀吸附。脱色完成后，用真空泵进行抽滤，得到脱色液，分别取10mL脱色液，用蒸馏水定容到100mL，测得其吸光值。最后计算脱色率、氮损失率。

2 结果与分析

2.1 活性炭用量对猪血粉酶解液脱色效果的影响

分别取100mL猪血粉酶解液于6个烧杯中，调节pH值至5.0，分别添加0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%的活性炭于烧杯中，在50℃下脱色3h，每隔0.5h测定脱色率和氮损失率，研究活性炭用量对猪血粉酶解液脱色率和氮损失率的影响，结果见图1和图2。

由图1和图2可知，随着脱色时间的延长，在相同温度和pH值条件下，脱色率和氮损失率均逐渐增加；当脱色时间相同时，随着活性炭用量的增加，脱色率和氮损失率均逐渐升高。当活性炭用量超过2.5%时，脱色率增幅减缓，氮损失率增大较多。因此，可初步确定活性炭用量为2.5%。

2.2 pH值对猪血粉酶解液脱色效果的影响

分别取100mL猪血粉酶解液于6个烧杯中，各添加2.5%的活性炭，分别调节pH值至2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，在50℃下脱色3h，每隔0.5h测定脱色率和氮损失率，研究pH值对猪血粉酶解液脱色率和氮损失率的影响，结果见图3和图4。

从图3和图4可看出，随着脱色时间的延长，在活性炭相同用量和相同温度条件下，脱色率和氮损失率都逐渐增加；当脱色时间相同时，随着pH值的上升，脱色率和氮损失率都逐渐降低。当pH值超过5时，脱色率下降幅度增大，同时氮损失率降低。因此，可初步确定较适pH值为5。

2.3 温度对猪血粉酶解液脱色效果的影响

分别取100mL猪血粉酶解液于6个烧杯中，各添加2.5%的活性炭，调节pH至5.0，分别在30，40，50，60，70，80℃下脱色3h，每隔0.5h测定脱色率和氮损失率，研究温度对猪血粉酶解液脱色率和氮损失率的影响，结果见图5和图6。

由图5和图6可知，随着脱色时间的延长，在相同pH值和相同活性炭用量的条件下，脱色率和氮损失率都逐渐增加；当脱色时间相同时，随着温度的上升，脱色率和氮损失率都逐渐升高。当温度超过50℃时，脱色率和氮损失率增幅均减缓。因此，可初步确定较适温度为50℃。

2.4 吸附时间对猪血粉酶解液脱色效果的影响

分别取100mL猪血粉酶解液于6个烧杯中，各添加2.5%的活性炭，调节pH至5.0，在50℃下脱色3h，每隔0.5h测定脱色率和氮损失率，研究吸附时间对猪血粉酶解液脱色率和氮损失率的影响，结果见图7和图8。

从图7和图8可看出，随着脱色温度的上升，在活性炭相同用量和相同pH值条件下，脱色率和氮损失率都逐渐增加；当脱色温度相同时，随着吸附时间的延长，脱色率和氮损失率均逐渐增大。当吸附时间超过2.0h时，脱色率和氮损失率增幅变缓。因此，可初步确定吸附时间为2.0h。

2.5 猪血粉酶解液脱色工艺条件的优化

为了得到猪血粉酶解液脱色最优工艺条件，在上述单因素试验基础上，以脱色率为测试指标，采用L9(34)正交试验对其进行优化，因素水平见表1，正交试验结果与极差分析见表2，方差分析见表3。

表1 因数水平表Tab.1 Factors and levels

表2 L9(34)正交试验结果与分析表Tab. 2 The results and analysis of L9(34) orthogonal test

由表2极差分析可知，对猪血粉酶解液脱色效果影响因素由主至次依次为活性炭用量，pH值，脱色温度，吸附时间，最优组合为A3B1C3D2，即猪血粉酶解液脱色的最优工艺条件为活性炭用量2.5%，pH4.0，脱色温度60℃，吸附时间1.0h。在此最优脱色工艺条件下，脱色率达92.20%，氮损失率为10.42%。从表3方差分析可看出，活性炭用量和pH值对猪血粉酶解液的脱色效果达到了极显著水平，脱色温度和吸附时间对猪血粉酶解液的脱色效果达到了显著水平。

表3 方差分析表Tab. 3 Analysis of variance

3 结论与讨论

用粉末活性炭对猪血粉酶解液进行脱色可得到理想的脱色效果，最佳脱色工艺参数为活性炭用量2.5%，pH4.0，脱色温度60℃，吸附时间1.0h，在此最佳脱色工艺条件下脱色率达92.20%，同时氮损失率为10.42%。

猪血粉酶解后生成低分子的肽和氨基酸，同时伴随血红素的形成，血红素的存在会干扰肽的分离提纯，需将其除去。粉末活性炭表面具有多孔隙结构，比表面积大，对血红素具有很强的吸附作用，并且吸附速度快，成本低，可再生[8]。

猪血粉酶解液的pH值对脱色效果有重要影响。酶解液pH值愈低，活性炭对酶解液的脱色效果愈好，这可能与构成血红素的卟啉化合物易溶于碱而难溶于酸的性质有关[9]。

猪血粉酶解液温度对脱色效果也有影响。酶解液温度愈高，脱色效果愈好，这是由于提高温度后分子热运动加快，血红素分子间碰撞几率增加，有利于絮体的形成，同时也加速了活性炭对色素的吸附[10]。