Bio-Plex悬液芯片技术在婴幼儿喘息综合征诊治中的应用*

袁宝莉， 张娜

广州医科大学附属第二医院儿科(广东广州 510260)

婴幼儿喘息是指婴幼儿时期表现为喘息症状的一组综合征，有反复发作的倾向，其中30%～50%的患儿可能发展为哮喘[1]。婴幼儿喘息性疾病虽然存在类似的喘息症状和体征，但其病因、发病机制及预后不尽相同，目前仍缺乏可靠指标来预测哮喘的发生[2]。近年来，一种高通量血清检测技术即悬液芯片技术(Bio-Plex suspension array system)，因其具有更高的检测灵敏度和更宽的检测信息量，被广泛应用于生命科学及临床医学的实验及诊断[3-4]。在本研究中，我们采用Bio-Plex悬液芯片技术，检测婴幼儿喘息患儿外周血中白细胞介素(IL)-4、IL-6、IL-10及IL-17的含量，探索可能诱发喘息反复发作的相关指标，以期做到早期干预，避免炎症进一步进展，尽可能减少哮喘的发生。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2017年1—12月广州医科大学附属第二医院儿科诊断为婴幼儿喘息综合征而住院的患儿，共计42例，均处于急性期。婴幼儿喘息综合征诊断标准：6个月内喘息发作3次以上，年龄6个月到5岁，临床表现为反复发作的咳嗽、喘息，听诊有喘鸣音。排除支气管、肺发育不良，支气管软化，呼吸道异物及先天性免疫缺陷等疾病。上述患儿进一步分为特应征组22例和非特应征组20例，仔细询问家长并详细体格检查，其中特应征组具有湿疹、过敏性鼻炎等特应征及特应征家族史；而非特应征喘息组，无湿疹、过敏性鼻炎等特应征及特应征家族史[5-6]。

对照组20例均为门诊健康体检者，无家族过敏史及近期无呼吸道感染婴幼儿，上述患儿采血前2周均未用过糖皮质激素及免疫调节剂。本研究经广州医科大学附属第二医院伦理委员会审查批准，所有患者检查前均告之本研究性质并签署知情同意书。3组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 3组一般资料比较

1.2 Bio-Plex高通量悬浮芯片细胞因子检测 于清晨空腹抽取各组儿童外周血2 mL，离心后分离血清，-70℃冷冻保存待检。所有血清样品检测前4℃水浴解冻，低温离心10 min后取上清待检。按说明书全程避光操作。Beads低速离心，每孔加入50 μL稀释好的Beads；Bio-Plex洗板机洗2次后，加入标品与样品，用避光膜将板封好，室温孵育850 r/min离心30 min；之后Bio-Plex洗板机洗3次；加入检测抗体25 μL，用避光膜将板封好，室温孵育850 r/min离心30 min；之后Bio-Plex洗板机洗3次；加入SA-PE 50 μL室温850 r/min离心10 min；之后Bio-Plex洗板机洗3次；加入125 μL assay buffer，封板，室温孵育850 r/min离心30 s，之后上机检测检测细胞因子IL-4、IL-6、IL-10、IL-17蛋白含量。

2 结果

2.1 血清中细胞因子表达水平的比较 与对照组比较，婴幼儿喘息综合征组血清IL-4、IL-6、IL-10、IL-17表达水平均显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

项目IL-4IL-6IL-10IL-17对照组7.5±4.066.2±22.517.6±3.76.2±1.4婴幼儿喘息综合征组15.9±4.8164.5±34.343.7±4.524.7±3.0t值-19.2-13.3-23.6-25.7P值<0.05<0.05<0.05<0.05

2.2 特应征组与非特应征组血清中细胞因子表达水平的比较 与非特应征组比较，特应征组血清IL-4、IL-6、IL-10、IL-17表达水平显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

项目IL-4IL-6IL-10IL-17特应征组18.3±3.9190.7±14.548.0±2.126.8±1.9非特应征组11.7±3.2135.9±13.538.9±1.222.4±2.2t值20.912.716.86.8P值<0.05<0.05<0.05<0.05

3 讨论

3.1 婴幼儿喘息综合征概述 儿童喘息性疾病具有反复发作的特点，部分过敏背景的喘息患儿可能会进展为哮喘。鉴于预后的不确定性，有学者提出了用“婴幼儿喘息综合征”的概念[7]。目前婴幼儿喘息综合征的发病机制尚不明确，推测可能与感染、变应原吸入以及先天性呼吸系统发育不良等因素有关[8]。如何从大量“婴幼儿喘息综合征”中，甄别出哮喘发生的高危人群，显得尤为重要。目前已有研究认为不同的喘息表型有不同的免疫细胞参与，因此早期识别特征性免疫细胞及免疫因子，并针对性干预，将有助于减少儿童喘息的反复发作，并对哮喘的发生发展有一定预防作用[9]。

3.2 Bio-Plex悬液芯片技术在科研中应用 Bio-Plex悬液芯片技术是一种新型的分子检测技术，集流式细胞术、激光、磁珠、数字信号处理诸多技术为一体[4]。由一百余种不同荧光标记的一系列聚苯乙烯微球组成，微球内部染上不同的荧光染料，每个微球可耦联特异性探针。检测样品时，微球表面的探针与目标分析物相结合，通过Bio-Plex悬液芯片技术系统的激光，识别微球编码和分析物，同步定量分析样品中的多种不同蛋白质、多肽、DNA或RNA片段。Bio-Plex悬液芯片技术相较于酶联免疫吸附试验(ELISA)，突破了仅能检测单一因子、灵敏度低、耗血量多的限制，其高效、高灵敏度，耗血量少的优势，日益受到科研工作者的亲睐[10]。Bio-Plex悬液芯片技术能显著提高单个样品的信息量，同时获得多种目标分析物的准确数据，为探索目标分析物之间的相互关联，奠定了基础。本研究在婴幼儿喘息综合征的研究中，应用Bio-Plex悬液芯片技术，同时定量获得特征性的免疫因子，并了解其相互关联，进一步探索婴幼儿喘息综合征的发病机制，便于指导临床早期干预。

3.3 婴幼儿喘息综合征与Th细胞 T细胞是免疫系统启动特异性免疫应答，抵御外来病原入侵的核心力量之一，其免疫功能的发挥依赖于不同环境、不同分化条件及不同功能状态。自1986年Mossman和Coffman首次报道了Thl、Th2细胞亚群以来。Thl/Th2失衡一直被公认为哮喘发病的主要机制[11]，具体表现为Th2优势反应，即Th2相关细胞因子IL-4分泌增加，进而刺激B淋巴细胞增殖，并分化为浆细胞，产生效应IgE。近年来学术界将能分泌IL-17细胞因子为特征的T淋巴细胞命名为Th17细胞，Th17细胞主要通过分泌细胞因子IL-17启动并扩大中性粒细胞炎症，从而参与喘息的发生、发展[12]，而IL-6是Th17细胞诱导和分化的关键因子[13]。IL-10是体内的一种抑制炎症因子，通过抑制肥大细胞、嗜酸细胞等炎症细胞的激活，并减少促炎因子的释放，来发挥抗炎作用。有研究表明，局部滴入IL-10治疗可抑制哮喘小鼠肺部的变应性炎性反应，改善其呼吸道症状，并降低哮喘小鼠血清IgE[14]。IL-10由CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)分泌，血清IL-10升高可介导呼吸道高反应和呼吸道炎症，参与了喘息的发病过程[15-16]。近年来学术界普遍认同在喘息发生过程中存在有Th1、Th2失衡，但Treg、Th17细胞与婴幼儿喘息综合征的关系，目前鲜有报道，本研究应用Bio-Plex悬液芯片技术，同时检测婴幼儿喘息患儿外周血Th2相关细胞因子IL-4及Th17相关细胞因子IL-6、IL-17和Treg相关细胞因子IL-10，探讨婴幼儿喘息综合征与Th细胞之间的相互关联。

本研究发现：婴幼儿喘息综合征组患儿外周血中IL-4、IL-6、IL-10、IL-17较对照组升高，结果提示Th2、Th17、Treg细胞可能参与了婴幼儿喘息的发病过程，且特应征组外周血IL-4，IL-6、IL-10、IL-17较非特应征组升高，进一步提示Th2、Th17、Treg细胞与特应征相关联，具体可能与婴幼儿喘息综合征患儿IL-4、IL-6、IL-17、 IL-10紊乱有关，也进一步阐明了婴幼儿喘息综合征患儿气道炎症呈多型性表现。曾有研究发现，IL-10这种抗炎因子在呼吸道合胞病毒毛细支气管炎及支气管哮喘患儿血清中，均较正常对照组降低，推测Treg细胞功能抑制[17]。本研究发现婴幼儿喘息患儿血清中IL-10升高，与上述研究结果并不一致，推测与疾病病种不同有关；本次研究涉及样本量尚不够多，亦需要增加样本量，并进行长期观测，才能得出更加客观及合理的研究结果。

综上所述，本研究对我们探索婴幼儿喘息的发病机制，突破了仅有的Thl/Th2失衡的局限，研究发现Th2、Th17、Treg细胞均与婴幼儿喘息综合征的发生、发展有关，特应征喘息患儿外周血中多种炎症因子含量增加。检测上述细胞因子对临床上判断喘息患儿预后，哮喘发生的预测具有一定意义，对目标患儿可以进行早期干预治疗，避免炎症进展为不可逆性气道损伤。本研究仅对喘息的急性发作期患儿进行研究，在将来的工作中还需纳入更大样本并且对慢性持续期和缓解期患儿展开研究，以进一步阐明外周血Th2、Th17、Treg细胞表达与婴幼儿喘息综合征的关系及其确切机制。