miRNA-155对慢性阻塞性肺疾病的影响及其与IL-35的相关性*

李云霞， 李男， 姜小川, 加慧， 夏书月

沈阳医学院附属中心医院呼吸内科(辽宁沈阳 110024)

非编码微小RNA-155(microRNA-155，miR-155)是miRNAs家族的重要成员，由23个核苷酸组成。研究发现，miR-155可以致小鼠肺部炎症及肺损伤，同时也证实miR-155在调节与T细胞功能相关的基因表达和炎症反应方面发挥重要的作用[1-2]。也有研究表明，miR-155在乳腺癌患者血清中的表达水平显著高于其在健康体检者血清中的表达水平[3]，在二次感染患者的巨噬细胞中表达明显增加[4]，miR-155已成为近年来的研究热点。2007年，国外研究首次报道白细胞介素-35(interleukin-35，IL-35)是一种具有强大抗炎作用的新型细胞因子[5]，此后IL-35的研究逐渐增多。最新的研究Chen等[6]报道，在哮喘及慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)患者血浆中，IL-35的浓度出现下降现象，该文献报道在哮喘和COPD患者中，IL-35很有可能参与Th2和Th17介导的炎症反应。本研究通过检测各组受试者中miR-155、IL-35的水平，分析miR-155与肺功能、血气指标、IL-35的相关性，从而明确miRNA-155对COPD的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机选取2017年6月至2018年6月我院呼吸内科门诊就诊的稳定期COPD(COPD稳定组)患者30例，住院的COPD急性加重期患者30例(AECOPD组)， 健康对照组30例，重度吸烟组30例。男58例，女62例。年龄40～80岁，平均(66±5.8)岁。

1.2 入选标准 (1)健康对照组：无吸烟史，无慢性呼吸系统疾病，无高血压、冠状动脉粥样硬化性心脏病、糖尿病、神经系统疾病、肝肾疾病等病史，年龄、性别与COPD稳定组匹配。(2)COPD稳定组：COPD诊断符合2011年由美国胸科学会(American Thoracic Society，ATS)和欧洲呼吸学会(European Respiratory Society，ERS)联合制定的诊治指南，且近3个月无COPD急性加重。(3)重度吸烟组：来自健康管理中心的吸烟的健康者，年龄40～80岁，每天吸20支及以上卷烟，吸烟指数(SI) ≥400。SI=每天吸烟支数×吸烟年数。(4)AECOPD组：符合以下条件：①曾诊断过COPD；②急性加重指标：发热，咳嗽加剧，痰量增多或出现黄痰；③呼吸困难指标：安静状态下，呼吸频率>20次/min；④肺功能受损指标：活动后气短加重或出现啰音；⑤经常使用COPD药物；⑥年龄>65岁。

1.3 排除标准 合并其他慢性呼吸系统疾病如哮喘、支气管扩张、肺结核、肺癌、肺间质疾病等，合并有其他系统慢性未控制疾病如高血压、糖尿病、冠状动脉粥样硬化性心脏病、严重肝肾功能损害、神经系统疾患等。

1.4 检测指标

1.4.1 外周血PBMC中miRNA-155的表达水平 抽取实验对象全血5 mL用percoll分离液法分离单个核细胞，采用RT-PCR技术来检测单个核细胞PBMC中miRNA-155的表达水平；RT-PCR试剂盒购自美国RD公司。PCR反转录条件：65℃、5 min，42℃、60 min，80℃、5 min，PCR扩增条件：预变性95℃、10 min,循环(40次)95℃、15 s→60℃、60 s，溶解曲线75℃→95℃，每20 s升温1℃，处理方法：ΔΔCT法：A=CT(目的基因，待测样本)-CT(内标基因，待测样本)，B=CT(目的基因，对照样本)-CT(内标基因，对照样本)(K=A-B)表达倍数=2-K。miRNA-155 RT引物序列：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGA-CCCCTAT-3′。PCR引物序列上游：5′-ACACTCCAGCTGGGTTAATGCTAATTGTGAT-3′，下游：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′。

1.4.2 外周血炎症因子IL-35的表达水平 采集外周空腹静脉血5 mL，2 000 r/min 离心20 min，提取上层血清于-80℃保存待测。ELISA方法测定血清标本中IL-35 的水平。试剂盒由上海西唐生物科技有限公司提供，严格按照说明书操作步骤进行。本实验采用双抗体夹心法。

1.4.3 各组受试者肺功能检查 检测指标为第1秒用力呼气容积(FEV1%)、FEV1占用力肺活量百分比(FEV1/FVC%)、用力肺活量(FVC%)。重复3次，取最好的结果。

1.4.4 各组受试者血气分析检查 抽取动脉血，查看血气分析结果，检测指标为PO2(mmHg)、PCO2(mmHg)、SO2%。

2 结果

2.1 各组血清中miR-155、IL-35的表达结果 健康对照组miR-155表达量最低，IL-35的表达量最高；AECOPD组miR-155表达量最高，IL-35的表达量最低；COPD稳定组miR-155表达较AECOPD组表达少，但较重度吸烟组表达增多，各组间比较，差异有统计学意义(F=25.21、19.98，P<0.01)。随着疾病的进展，IL-35的表达量逐渐下降，miR-155表达逐渐升高，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

项目例数miR-155-5pIL-35(pg/mL)健康对照组300.24±0.06326.25±56.23重度吸烟组300.56±0.05∗224.12±16.25∗COPD稳定组301.13±0.15∗130.44±36.14∗AECOPD组302.24±0.25∗34.12±21.01∗F值25.2119.98P值0.000.00

*与健康对照组比较P<0.01

2.2 血清中miR-155-5p与FEV1%、FEVI/FVC%、FVC%的相关性分析 根据Spearman 相关分析，血清中miR-155-5p的水平与FEV1%的水平呈负相关(r=-0.706 2，P<0.01)；与FEVI/FVC%无相关性；与FVC %无相关性。见图1。

图1 miR-155与FEV1%的相关分析

2.3 血清中miR-155-5p与血气指标的相关性分析 根据 Spearman 相关分析，血清中miR-155-5p的水平与PO2的水平呈负相关(r=-0.739 7，P<0.01)；与PCO2无相关性。见图2。

图2 miR-155与PO2的相关分析

2.4 miR-155与IL-35表达水平的相关性分析 通过Spearman相关分析，miR-155与血清中IL-35的表达水平呈负相关(r=-0.652 2，P<0.01)。见图3。

图3 miR-155与IL-35的相关分析

3 讨论

众所周知，COPD是一种慢性气道炎症，氧化/抗氧化失衡、蛋白酶/抗蛋白酶失衡是COPD发病机制的关键环节[7-8]。COPD发病过程中常常伴有IL-17、IL-10、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等细胞因子表达的异常。研究报道，在COPD发病过程中，IL-17通过刺激 IL-6、IL-8、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及基质金属蛋白酶2(MMP-2) 等炎性细胞因子，同时诱导气道黏液分泌，促进气道重塑，而最终导致其靶器官病变。但IL-35在COPD中如何表达，国内外相关报道极少。目前研究证明，IL-35是一种具有强大抗炎作用的新型细胞因子[9-11]，作为免疫抑制性细胞因子，IL-35与COPD、糖尿病、哮喘等疾病密切相关[12-14]。我们的研究结果表明，健康对照组IL-35的平均水平为(326.25±56.23)pg/mL，重度吸烟组IL-35的平均水平为(224.12±16.25)pg/mL，COPD稳定组为(130.44±36.14)pg/mL，AECOPD组为(34.12±21.01)pg/mL，随着病情的进展，IL-35的表达量呈现下降趋势，说明IL-35与COPD的发病过程密切相关，且很可能对COPD的进展起保护作用。

miRNAs是一类长度为19～25个核苷酸的非编码RNA，参与多种重要生物学过程[15]。miRNAs究竟在COPD发病机制中扮演何种角色，目前尚不知晓。研究显示，miRNAs靶向控制哺乳动物30%的基因组表达，且在细胞生长、分化、凋亡、代谢及病毒感染、肿瘤发生等病理生理过程中发挥至关重要的作用[16-17]。近年来众多研究探讨了某些miRNAs在COPD发病机制中的作用，并阐明其作为COPD早期诊断的生物标志物的可能性，是COPD疾病诊断、治疗以及预后评估方面的一个新突破。miR-155是一种经典的多功能miRNA，参与T细胞、B细胞和巨噬细胞的发育、分化、活化、增殖及其稳态的维持[18-20]，而自身免疫性疾病均存在着抗原提呈细胞(antigen presenting cells，APCs)活化和抗原提呈，以及T和B细胞的活化、增殖、分化等过程[21-22]。迄今为止，综合全球文献发现在已知的miRNAs中，miR-155是与肿瘤性疾病和炎症性疾病最相关的miRNAs之一。miR-155对COPD患者有何影响，及其与COPD患者中IL-35的相关性，目前无相关文献报道，是本研究的目的。

我们的研究结果表明，健康对照组miR-155的表达量最低，AECOPD组miR-155表达量最高，COPD稳定组miR-155表达较AECOPD组表达少，但较重度吸烟组表达增多，各组间比较，差异有统计学意义(P<0.01)。随着病情的进展，miR-155的表达量逐渐升高。根据Spearman相关分析，血清中mir-155-5p的水平与PO2的水平、FEV1%的水平、IL-35的表达水平均呈负相关(r=-0.739 7，-0.706 2、-0.652 2；P<0.01)，差异有统计学意义。说明miR-155参与了COPD的发病过程，是导致肺损伤的重要物质，对COPD产生负性效应，而IL-35是一种保护性细胞因子，两者之间呈现明显的负相关，具体的信号通路及传导过程是我们下一步课题的研究目标。