红树林近平滑假丝酵母菌胞外多糖在外阴阴道假丝酵母菌病模型小鼠中的效果评估*

王英， 裴华， 贝宁， 贝筝， 杨文， 王华民， 余平△

1中南大学基础医学院免疫学系(湖南长沙 410013)； 2海南医学院病原生物学与免疫学实验室(海南海口 571101)； 3海南省干部疗养院三科(海南海口 571100)

红树林是陆地和海洋之间转换的高产生态系统，其土壤蕴藏着丰富的海洋微生物资源，目前已分离鉴定的红树林真菌超过200种，成为海洋真菌的第二大类群。该生态系统中土壤强酸性沼泽化、盐渍化。红树林真菌为适应盐、有机质含量高的特殊环境生存，其胞外多糖(exopolysaccharide, EPS)结构较陆生真菌可能存在较大差异[1]。课题组2010年在海南演丰镇红树林自然保护区分离获得一株真菌，鉴定为近平滑假丝酵母菌(C.parapsilokis)。课题组2015年经小鼠体内实验初步证实，其EPS能明显增强小鼠机体的免疫功能[2]。2016年3—7月，课题组为了进一步研究该EPS更多的生物学作用，又构建了BALB/c小鼠外阴阴道假丝酵母菌病(vulvovaginal candidiasis, VVC)模型，并应用EPS进行阴道局部干预，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物 BALB/c小鼠，8～10周龄, 24～28 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。

1.2 试剂和菌种C.parapsilokisEPS由本课题提取；发酵培养基用大豆粉玉米粉培养基；苯甲酸雌二醇注射液(杭州动物药品厂，批号111015)；白假丝酵母菌ATCC10231，购自广东省微生物研究所。

1.3 仪器设备 生物安全柜(中国海尔)；生化培养箱(上海博迅)；电子分析天平(上海精胜)；高效液相色谱仪(日本岛津)；生物显微镜(日本奥林巴斯)；低速台式离心机(上海天美)。

1.4 方法

1.4.1 多糖提取纯化及鉴定[3-4]课题组自海南地区红树林分离获得1株C.parapsilokis菌株，发酵后收集上清液中EPS成分，乙醇沉淀、并利用链蛋白酶+Sevag法联合脱蛋白鉴定多糖纯度，冷冻干燥后获得EPS干粉。采用Sephacryl S-400凝胶柱层析逐级分离纯化后，应用高效凝胶渗透色谱法进行相对分子质量鉴定和单糖组成进行检测。

1.4.2 BALB/c小鼠VVC模型的构建 参考文献[5-7]构建小鼠VVC模型。60只雌性BALB/c小鼠(8～10周龄，24～28 g)随机均分为雌激素诱导的VVC组(V组，n=20)、EPS干预和雌激素诱导的VVC组(E组，n=20)、仅进行雌激素化的阴性对照组(C组，n=20)和空白对照组(B组，n=20)。V组、E组和C组小鼠在接种前6 d开始皮下注射含有0.1 mg苯甲酸雌二醇的油剂0.1 mL，每2 d 1次。B 组皮下注射同等体积的无菌橄榄油。给药1 周后，E组和V组接种白假丝酵母菌(ATCC 10231)孢子5×107, B和C组接种等体积的PBS。

1.4.3 BALB/c小鼠VVC模型的EPS治疗干预 白假丝酵母菌接种后第1天E组开始阴道内给予含30 μg EPS的PBS 100 μL，连续给予6 d，V、B、C各组给予等体积PBS。接种后第4、7、14天每天随机抽选各组小鼠5只，收集各组小鼠阴道灌洗液进行菌落计数。收集完成后处死小鼠，分离阴道组织，部分阴道组织用4%多聚甲醛固定。制成石蜡切片，进行HE染色[7-9]。

1.5 EPS治疗干预后基因芯片检测 取EPS干预后第4天的V组小鼠和E组小鼠，处死后分离阴道组织，取近阴道壁约1 mm厚度的组织切割下来后液氮保存，用于总RNA提取和后续芯片检测。芯片检测采用Agilent Whole Mouse Genome Oligo Microarray(4×44K)。

2 结果

2.1 EPS的富集纯化及组分鉴定 课题组获得的EPS相对分子质量约530 kD。经薄层色谱分析，主要是由葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸等单糖组成的杂多糖。

2.2 BALB/c小鼠VVC模型的构建 E组和V组小鼠于接种白假丝酵母菌3～5 d后出现外阴红肿，阴道灌洗液可见豆渣样分泌物。C组和B组小鼠未见明显异常改变。显示BALB/c小鼠VVC感染模型建模成功。见表1，图1。

2.3 BALB/c小鼠VVC模型的EPS治疗干预 小鼠阴道局部白假丝酵母菌载量并未因EPS的干预发生明显改变，但是阴道局部组织石蜡切片观察发现，中性粒细胞计数(PMN)的浸润程度明显减轻。见图2-A、2-B、2-C。

2.4 EPS-1治疗干预后基因芯片检测 应用EPS干预后，阴道组织局部多种趋化因子表达水平明显下调，S100A8、S100A9等表达水平下调，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表1各组小鼠不同时间点阴道的载菌量

组别干预后4 d干预后7 d干预后14 dV组15.32±0.67∗9.46±0.31∗1.58±0.27E组7.01±0.21△2.25±0.11△0.00△C组0.00 ∗△0.00 ∗△0.00△B组0.00 ∗△0.00 ∗△0.00△

*与E组同时间比较P<0.05；△与V组同时间比较P<0.05

图1 小鼠VVC模型大体观

3 讨论

近年学者们对红树林内生菌的资源和所产生的代谢产物的研究发现，红树林来源的微生物群是新的生物活性天然产物的丰富资源[10]。文献有报道真菌多糖具有免疫调节作用、抗肿瘤活性等多种的生物学活性[11-14]。多篇文献研究表明来自红树林的真菌产物对白假丝酵母菌具有一定的生物学活性[10,15-16]。这些研究说明这类真菌是潜在的微生物药物开发资源。

A：VVC小鼠阴道内PMNs浸润情况(HE，10×40)；B：EPS作用后VVC小鼠阴道内PMNs浸润情况(HE，10×40)；C：阴道灌洗液中白假丝酵母菌CFU计数

图2小鼠VVC模型

组别S100A8S100A9V组1.00±0.001.00±0.00E组0.25±0.05∗0.19±0.04∗

*与V组比较P<0.01

有多样性次级代谢产物美誉的酵母菌广泛存在于自然生态环境中，种类丰富，代谢产物多样, 具有重要的经济效益和实用价值。课题组2010年在海南演丰镇红树林自然保护区分离获得一株C.parapsilokis，2015年经小鼠体内实验已初步证实，其EPS被证实能增强小鼠机体的免疫功能[2]。多糖可能携带丰富的生物学信息。3个核苷酸或氨基酸所组成的所有可能序列数仅为6种，而3个单糖最多可以有27 648种可能的排列方式，加上寡糖链的连接方式和分支结构的不同，多糖势必承载着巨大的生物信息量，其中可能存在多种独特的生物学活性。即使基本组成如单糖成份、寡糖链连接方式和分支结构完全相同的多糖，由于分子量大小的不同，其生物学功能也可能存在巨大差异[17]。

微生物胞外多糖在食品、医药、化工等众多领域广泛应用。在临床医学中，EPS有增强机体抗肿瘤、抗细菌、抗病毒、抗寄生虫等的性能。细胞工厂及其广泛应用如分子治疗等正在蓬勃发展，让微生物为发现最安全、最有效的药物途径具有广阔的前景[18]。

假丝酵母属真菌是最常见的人类条件致病性真菌，影响人群广泛。以其引发的VVC为例，75%的育龄妇女罹患过此疾病，且其中每年约有3 000万人复发[9,19]。抗真菌药物治疗虽然对假丝酵母菌感染有效，但耐药性增加成为日益关注的问题，并且这些药物的应用对于预防感染复发并无效果。在这一形势下，寻找抗假丝酵母菌属真菌感染的其他途径显得十分紧迫和重要。

寻找真菌独特的抗原表位并引发强度适当的体液免疫应答，即人为的免疫干预是否可在这一领域获得成功，长期以来备受关注。然而迄今为止，阴道黏膜局部免疫应答和假丝酵母菌属真菌相互作用的关系并未完全明确，各种类型的免疫应答在假丝酵母菌感染致病中的作用一直存有争议[20]。

课题组于2016年3—7月构建了BALB/c小鼠VVC模型，并应用分离自红树林的C.parapsilokisEPS进行了阴道局部干预。结果发现小鼠阴道局部白假丝酵母菌载量并未因EPS的干预发生明显改变，但是阴道局部组织石蜡切片观察发现PMNs的浸润程度明显减轻。根据结果分析推测，该多糖引发的这一保护性效应可能与局部的体液免疫应答引发有关。为了进一步明确发生机制，课题组收集阴道组织经总RNA提取后进行了后续芯片检测。结果发现，应用EPS干预后，阴道组织局部多种趋化因子表达水平明显下调， S100A8、S100A9等表达水平下调，TGF-β表达水平明显上调。

C.parapsilokis所分泌EPS在小鼠VVC感染模型中，对阴道局部真菌负荷并无明显影响；但该EPS的应用可在 VVC模型中具有较好的抗炎效应。这一作用与EPS对 S100A8/A9的剂量依赖阻碍表达相关。目前资料尚不完整，该EPS对其他趋化因子 CCL4、CCL5、CXCL10 的表达阻碍效应，有待于在后续研究中继续探索。但本次研究给予作者提示EPS干预后有可能引发的特异性体液免疫应答有助于改善BALB/c小鼠VVC模型相关症状体征。