柴连感冒颗粒对大鼠的长期毒性研究

黄未劼，张同辉，蔡泽宇，庞聪，沈枕，方攀，潘经媛

(1.武汉大学药学院，武汉 430071；2.湖北省医药工业研究院有限公司，武汉 430061；3.武汉双龙药业有限公司，武汉 430075)

柴连感冒颗粒处方为临床应用多年的经验方，由柴胡、川连、黄芩、赤芍、蔓荆等中药组成提取的复方制剂，具有解表宣肺、化湿和中之功，主要用于治疗感冒风寒、风寒挟湿证者。为研究该制剂的长期毒性反应，根据新药长期毒性指导原则和方法[1-3]，临床给药为7 d，因此笔者采用大鼠连续灌胃给药31 d，利用受试动物的各项生理病理指标评价药物的安全性，以期为临床用药提供参考。

1 材料与方法

1.1药物 柴连感冒颗粒(湖北省医药工业研究院有限公司研发中心制备提供，批号：20130603)，每1 g干膏粉相当于生药3.51 g，临用时每100 g干膏粉加挥发油0.62 mL混匀。

1.2实验动物 SPF级SD大鼠，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司。给药时体质量：雌性大鼠152.4～173.4 g，雄性大鼠167.1～190.8 g。均6～7周龄，共120只，雌雄各半。实验动物生产合格证号：SCXK(沪)2013-0016，实验动物使用许可证号：SYXK(鄂)2009-0023。将大鼠饲养于屏障系统，明暗各12 h交替，室温20.7～23.5 ℃，相对湿度43.3%～69.0%。SPF大鼠繁殖颗粒饲料(批号：14023113)和玉米芯垫料(批号：14019811)均由北京科澳协力饲料有限公司提供；饲料经60Co灭菌处理，垫料经134 ℃、7 min高压灭菌后使用。饮用水为高压灭菌水，符合生活饮用水卫生标准GB5749-85要求。实验前大鼠检疫5 d，观察记录大鼠行为活动、摄食量、体质量、精神状况等，选择健康、正常大鼠作为受试动物，若雌性则用无孕大鼠。

1.3仪器 3700全自动血球分析仪(美国雅培公司)，CA-1500全自动血凝分析仪[希森美康医用电子(上海)有限公司]，7100全自动生化分析仪(日本日立公司)，CAV2101电子天平和Adventurer-AR3130电子天平[奥豪斯(上海)有限公司]，TP 1020全自动脱水仪和EG1140全自动包埋仪(德国LEICA公司)、HM360轮转切片机(德国MICROM公司) 和 E600光学显微镜(日本Nikon公司)。

1.4实验方法 将大鼠按性别和体质量分层随机分为柴连感冒颗粒大、中、小剂量组(给药剂量以生药计，分别为45.0，24.0和12.0 g·kg-1，分别相当于人临床日拟用量的52，28，14倍)及溶媒对照组(给予纯化水)，每组30只，雌雄各半，每日灌胃给药1次，剂量20 mL·kg-1，连续31 d。

1.5观察指标 给药期间每周测量体质量和摄食量1次，并根据测得的体质量调整给药量，给药期间每天观察并记录动物行为、活动等情况。连续给药31 d后各组取大鼠16只(雌雄各半)，停药14 d后各取14只(雌雄各半)，禁食12 h，进行血液学和血液生化学检查，称取脏器质量，计算质量指数。①血液学指标：红细胞计数(RBC)、血红蛋白(Hb)、红细胞容积(HCT)、平均红细胞容积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(average red blood cell hemoglobin，MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(mean corpuscular hemoglobin contentration，MCHC)、网织红细胞计数(reticulocyte count，RET)、白细胞计数及其分类(white blood cell count and its classification，WBC&DC)、血小板计数(blood platelet，PLT)、凝血酶原时间(prothrombin time，PT)、凝血酶时间(thrombin time，TT)；②血液生化学指标：丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Crea)、白蛋白(ALB) 、总蛋白(TP)、总胆红素(T-BiL)、血糖(GLU)、三酰甘油 (TG)、总胆固醇(total cholesterol，T-CH)、 K+浓度、Cl-浓度、Na+浓度、肌酸磷酸激酶(creatine phosphate kinase，CK)。③系统尸体解剖：对各脏器全面肉眼尸检；④脏器称重：称心、肝、肾、脾、肺、脑、胸腺、肾上腺、睾丸、附睾、卵巢、子宫质量，并计算脏器系数；⑤病理组织学检查：脑(大脑、小脑、脑干)，脊髓(颈、胸、腰段)，垂体，胸腺，甲状腺，甲状旁腺，食管，唾液腺，胃，小肠和大肠，肝脏，肾脏，肾上腺，脾脏，胰腺，气管，肺脏，主动脉，心脏，附睾，睾丸，卵巢，子宫，前列腺，乳腺，坐骨神经，膀胱，淋巴结和骨髓及所有异常组织，10%甲醛溶液固定，进行病理组织学检测。

2 结果

2.1一般状况、体质量、进食量 4组大鼠实验期间一般行为无异常，毛色光洁，腺体分泌、呼吸、粪便性状正常，实验期间均无死亡。

4组大鼠体质量均增长，其中柴连感冒颗粒大剂量组雄性大鼠体质量增长较溶媒对照组慢(P<0.01或P<0.05)，柴连感冒颗粒大剂量组雌性大鼠体质量与溶媒对照组比较差异无统计学意义，见表1，2。

与溶媒对照组比较，柴连感冒颗粒各剂量组雌性大鼠进食量均差异无统计学意义，柴连感冒颗粒大剂给药期，n=15；恢复期，n=7量组雄性大鼠给药第7天，第14天进食量减少(P<0.01)，见表3，4。

表14组雌性大鼠不同时间体质量测定结果

组别给药0 d给药7 d给药14 d给药21 d给药28 d给药31 d停药7 d停药14 d溶媒对照组 162±6 194±10 218±13 239±15 249±13 258±14 274±18 280±16柴连感冒颗粒 小剂量组 162±6 193±10 213±9 227±14 240±12 247±15 268±17 277±14 中剂量组 162±6 195±13 219±13 240±15 254±18 261±20 266±11 277±10 大剂量组 162±6 190±8 213±7 234±12 251±13 258±14 262±9 272±10

Treatment period,n=15; recovery period,n=7

表24组雄性大鼠不同时间体质量测定结果

组别给药0 d给药7 d给药14 d给药21 d给药28 d给药31 d停药7 d停药14 d溶媒对照组 177±6 232±10 287±12 329±15 361±17 379±16 411±17 438±20柴连感冒颗粒 小剂量组 177±5 230±12 283±13 328±17 358±19 376±23 410±18 436±18 中剂量组 177±6 231±8 286±11 329±16 355±23 372±24 402±22 426±26 大剂量组 177±5 212±8*1 257±11*1 293±12*1 320±14*1 333±15*1 378±15*1 407±15*2

给药期，n=15；恢复期，n=7。与溶媒对照组比较*1P<0.01，*2P<0.05

Treatment period，n=15；recovery period，n=7。Compared with control group，*1P<0.01，*2P<0.05

2.2血常规检查结果 与溶媒对照组比较，柴连感冒颗粒中、大剂量组血常规均差异无统计学意义，柴连感冒颗粒小剂量组TT高于溶媒对照组(P<0.05)，其他血常规指标差异无统计学意义。见表5。

2.3血液生化指标检查结果 连续给药31 d，与溶媒对照组比较，柴连感冒颗粒小剂量组生化指标差异无统计学意义；柴连感冒颗粒中剂量组GLU、T-CHO低于溶媒对照组(P<0.01)，Cl-、Na+浓度高于溶媒对照组(P<0.05)；柴连感冒颗粒大剂量组GLU 和T-CHO低于溶媒对照组(P<0.01)，TG高于溶媒对照组(P<0.05)。结果见表6。

停药14 d后，柴连感冒颗粒小、中剂量组AST、CK低于溶媒对照组(P<0.01)，柴连感冒颗粒中、大剂量组BUN高于溶媒对照组(P<0.05,P<0.01)。结果见表6。

2.4系统尸检及脏器系数 连续给药31 d及停药14 d，大体解剖检查未见明显异常。连续给药31 d，柴连感冒颗粒大剂量组雌性大鼠肝、肾上腺系数高于溶媒对照组(P<0.01)，胸腺系数低于溶媒对照组(P<0.01)；柴连感冒颗粒大剂量组雄性大鼠肝、肾上腺系数高于溶媒对照组(P<0.01)。停药14 d，柴连感冒颗粒小剂量雌性大鼠组子宫系数高于溶媒对照组(P<0.05)；柴连感冒颗粒大剂量组雄性大鼠脑系数高于溶媒对照组(P<0.05)。结果见表7、表8。

2.5组织学检查 连续给药31 d及停药14 d，柴连感冒颗粒大剂量组有个别大鼠出现盲肠黏膜下出血，肝淤血、脂肪变性，肝髓外造血，肺间质增生，肺泡增厚，肾小管上皮细胞变性、肿胀，管腔内有丝网状物分布，间质细胞增生，肾实质萎缩，膀胱黏膜上皮细胞变性脱落，胸腺髓质出血，但这些病变同样出现在溶媒对照组，且病变例数与病变程度无明显差异，这些病变也是SD大鼠常见自发性病变[4]，故上述变化与供试品无关。

表34组雌性大鼠不同时间进食量测定结果

Tab.3Food-intakeoffourgroupsoffemaleratsatdifferenttimepoints

g·(100 g)

给药期，n=8；恢复期，n=7(n为笼数)

Treatment period,n=8; recovery period,n=7(n means cage number)

表44组雄性大鼠不同时间进食量测定结果

Tab.4Food-intakeoffourgroupsofmaleratsatdifferenttimepoints

g·(100 g)

与溶媒对照组比较，*1P<0.01；给药期，n=8；恢复期，n=7(n为笼数)

Compared with control group，*1P<0.01；Treatment period,n=8; recovery period,n=7(n means cage number)

表54组大鼠血液学指标检查结果

Tab.5Resultsofhematologicalexaminationinfourgroupsofrats

组别与时间RET/%RBC/(×1012·L-1)Hb/(g·L-1)HCT/%MCV/flMCH/pgMCHC/(g·L-1)WBC/(×109·L-1)给药31 d(n=16) 溶媒对照组4.70±2.527.17±0.60138±1064.6±4.290.5±2.719.3±0.4213±35.41±1.23 柴连感冒颗粒 小剂量组3.26±1.467.17±0.63137±1163.4±5.088.5±1.919.0±0.4215±24.87±2.18 中剂量组4.02±2.686.92±0.63132±961.5±3.989.1±3.619.1±0.7214±24.91±0.96 大剂量组3.69±1.637.13±0.68134±1062.7±4.488.2±3.018.9±0.7214±36.82±2.44停药14 d(n=14) 溶媒对照组4.36±0.927.19±0.62133±763.7±2.988.9±4.218.6±0.7209±44.39±1.36 柴连感冒颗粒 小剂量组4.78±0.677.02±0.45133±762.5±2.589.2±3.618.9±0.4212±54.09±1.79 中剂量组4.26±0.597.20±0.60134±863.7±3.988.6±3.218.7±0.7211±34.16±1.10 大剂量组4.78±0.887.00±0.33130±562.2±2.289.0±2.518.7±0.4210±34.84±1.06组别与时间NEULYMMONOEOSBASO%PLT/(×109·L-1)PTTTs给药31 d(n=16) 溶媒对照组12±482±53±21±02±1 912±6210.1±0.9 56±4 柴连感冒颗粒 小剂量组14±680±63±11±02±1 950±6310.2±2.3 60±4*1 中剂量组13±782±93±11±02±1 962±659.7±1.7 57±4 大剂量组14±681±83±21±02±1 924±6810.3±1.4 55±4停药14 d(n=14) 溶媒对照组11±485±52±11±02±1 882±9511.8±2.5 62±5 柴连感冒颗粒 小剂量组10±486±52±11±01±0 940±9111.3±1.3 62±4 中剂量组9±387±22±11±12±1 868±21811.5±1.8 61±4 大剂量组11±585±52±11±02±1 928±10111.9±2.7 60±4

与溶媒对照组比较，*1P<0.05

Compared with solvent control group*1P< 0.05

表64组大鼠血液生化指标测定结果

Tab.6Resultofbloodbiochemicalindexinfourgroupsofrats

组别与时间ALTASTALPCK(U·L-1)TPALB(g·L-1)T-BiLCrea(μmol·L-1)给药31 d(n=16) 溶媒对照组48±6 90±7116±41 317±7458±234±22.3±0.941±3柴连感冒颗粒 小剂量组52±9 90±10117±40 307±9560±335±21.8±0.740±2 中剂量组49±8 92±20127±37 321±14259±334±12.4±0.941±3 大剂量组54±9 90±19149±39 353±25360±335±12.4±0.942±4停药14 d(n=14) 溶媒对照组45±7 98±998±41 379±7759±234±12.3±0.946±3 柴连感冒颗粒 小剂量组49±6 81±15*195±29 214±124*159±334±12.4±0.946±5 中剂量组48±7 77±8*196±42 204±62*160±334±21.5±0.847±5 大剂量组48±9 91±11118±47 328±9160±335±22.1±0.745±4

续表64组大鼠血液生化指标测定结果

Tab.6Resultofbloodbiochemicalindexinfourgroupsofrats

组别与时间GLUBUNT-CHOTGK+Na+Cl-(mmol·L-1)给药31 d(n=16) 溶媒对照组7.6±0.86.4±1.01.41±0.32 0.46±0.084.9±0.4 147±2 103±2 柴连感冒颗粒 小剂量组7.0±0.96.2±0.71.20±0.22 0.47±0.114.9±0.3 148±2 105±2 中剂量组6.6±0.7*16.6±1.41.00±0.25*1 0.51±0.204.8±0.3 149±2*2 106±2*2 大剂量组6.6±0.8*16.9±1.80.77±0.23*1 0.62±0.22*25.1±0.2 146±2 105±2停药14 d(n=14) 溶媒对照组7.2±0.56.5±0.71.68±0.39 0.50±0.174.6±0.4 139±1 103±2 柴连感冒颗粒 小剂量组7.4±1.06.9±0.81.87±0.36 0.52±0.204.3±0.2 139±1 104±2 中剂量组7.6±0.67.5±0.9*21.68±0.34 0.44±0.074.5±0.4 139±1 104±2 大剂量组6.9±0.57.6±1.1*11.87±0.39 0.53±0.114.9±0.4 139±1 103±2

与溶媒对照组比较，*1P<0.01，*2P<0.05

Compared with solvent control group，*1P<0.01，*2P<0.05

表74组雌性大鼠脏器系数测定结果

组别与时间心系数肝系数肾系数脾系数肺系数给药31 d(n=8) 溶媒对照组0.354±0.0183.309±0.4250.752±0.0420.248±0.0380.407±0.027 柴连感冒颗粒 小剂量组0.359±0.0253.564±0.2870.798±0.0490.254±0.0440.421±0.024 中剂量组0.355±0.0163.713±0.2580.815±0.0600.292±0.0470.396±0.032 大剂量组0.363±0.0143.989±0.316*10.798±0.0600.260±0.0510.332±0.122停药14 d(n=7) 溶媒对照组0.331±0.0142.720±0.1530.698±0.0420.252±0.0330.392±0.031 柴连感冒颗粒 小剂量组0.335±0.0152.652±0.1280.697±0.0380.237±0.0160.376±0.011 中剂量组0.335±0.0292.915±0.2720.709±0.0330.228±0.0190.391±0.025 大剂量组0.369±0.0702.928±0.1770.727±0.0610.259±0.0200.400±0.025组别与时间肾上腺系数脑系数卵巢系数子宫系数胸腺系数给药31 d(n=8) 溶媒对照组0.031±0.0040.701±0.0360.055±0.0110.217±0.0600.224±0.028 柴连感冒颗粒 小剂量组0.033±0.0040.724±0.0420.082±0.0910.234±0.1020.193±0.027 中剂量组0.034±0.0060.726±0.0950.058±0.0100.224±0.0580.198±0.035 大剂量组0.039±0.003*10.687±0.0520.055±0.0070.187±0.0190.169±0.014*1停药14 d(n=7) 溶媒对照组0.029±0.0040.664±0.0480.050±0.0040.178±0.0410.185±0.036 柴连感冒颗粒 小剂量组0.029±0.030.669±0.0450.051±0.0040.249±0.060*20.167±0.010 中剂量组0.029±0.0030.675±0.0420.043±0.0050.171±0.0450.160±0.031 大剂量组0.030±0.0020.704±0.0900.052±0.0140.176±0.0510.174±0.029

与溶媒对照组比较，*1P<0.01，*2P<0.05

Compared with solvent control group，*1P<0.01，*2P<0.05

表84组雄性大鼠脏器系数测定结果

组别与时间心系数肝系数肾系数脾系数肺系数给药31 d(n=8) 溶媒对照组0.324±0.0183.107±0.2200.805±0.1200.212±0.0320.336±0.020 柴连感冒颗粒 小剂量组0.332±0.0223.317±0.3080.809±0.0850.200±0.0270.354±0.036 中剂量组0.334±0.0393.336±0.3290.889±0.0900.223±0.0400.351±0.027 大剂量组0.341±0.0123.536±0.190*10.853±0.0380.209±0.0150.360±0.029停药14 d(n=7) 溶媒对照组0.309±0.0212.949±0.2980.710±0.0290.215±0.0310.304±0.020 柴连感冒颗粒 小剂量组0.316±0.0193.020±0.3350.696±0.0210.234±0.0300.295±0.010 中剂量组0.307±0.0292.973±0.1160.720±0.0710.203±0.0180.310±0.017 大剂量组0.316±0.0103.102±0.1230.767±0.0640.226±0.0250.312±0.019组别与时间肾上腺系数脑系数卵巢系数子宫系数胸腺系数给药31 d(n=8) 溶媒对照组0.015±0.0020.515±0.0320.734±0.0460.234±0.0350.144±0.026 柴连感冒颗粒 小剂量组0.017±0.0010.528±0.0450.734±0.0780.230±0.0300.133±0.026 中剂量组0.017±0.0010.526±0.0480.719±0.0820.227±0.0260.131±0.033 大剂量组0.021±0.003*10.557±0.0280.773±0.0610.242±0.0300.123±0.016停药14 d(n=7) 溶媒对照组0.014±0.0020.446±0.0220.608±0.0270.226±0.0260.124±0.023 柴连感冒颗粒 小剂量组0.013±0.0020.455±0.0270.631±0.0370.230±0.0150.121±0.010 中剂量组0.014±0.0020.450±0.0220.625±0.0610.230±0.0130.115±0.019 大剂量组0.015±0.0010.490±0.038*20.641±0.0510.244±0.0300.110±0.023

与溶媒对照组比较，*1P<0.01，*2P<0.05

Compared with solvent control group，*1P<0.01，*2P<0.05

3 讨论

根据长期毒性相关指导原则[1-2]，剂量设计时大剂量应出现明显毒性反应或达到最大给药量，或系统暴露量达到临床系统暴露量的50倍。由于考虑供试品最高配制浓度(太黏稠致灌胃针难以推送)、给药体积及实验期限等因素，采用最大浓度0.641 g浸膏粉·mL-1(生药2.25 g·mL-1)×20 mL·kg-1=生药45 g·kg-1，即设大剂量，相当于临床拟用剂量的52倍；小剂量为生药12 g·kg-1，高于大鼠药效学有效剂量(生药10 g·kg-1)，中剂量为生药24 g·kg-1，由于给药期设为31 d，因此恢复期设为14 d。

本实验结果显示，连续31 d灌胃给予不同剂量柴连感冒颗粒，各组大鼠实验期间一般状况无异常改变；大鼠体质量均增长，其中柴连感冒颗粒大剂量组雄性大鼠体质量较溶媒对照组增长缓慢，由于给药浓度较高，且雄性大鼠体质量较大增加给药难度，对给药操作可能有一定影响。雌性大鼠体质量增长无异常。提示大剂量柴连感冒颗粒能使雄性大鼠体质量增长减缓。摄食量检查，柴连感冒颗粒小、中剂量组与溶媒对照组比较差异无统计学意义，柴连感冒颗粒大剂量组雄性大鼠给药7～14 d进食量减少，雌性大鼠进食量无影响，提示大剂量柴连感冒颗粒在给药初期对雄性大鼠摄食量有短暂抑制作用。

血液学检查结果显示，各剂量组血液学各项指标均未见异常，提示柴连感冒颗粒对血液学各项指标无影响。凝血检查结果显示，给药末期柴连感冒颗粒小剂量组TT高于溶媒对照组，但绝对值相差不大，且无明显剂量相关性，故该变化与供试品无关。血液生化结果显示，给药末期及恢复期结束，个别指标如GLU、AST、BUN、TG、CK、Na+和Cl-与对照组比较偶有统计学差异，但均在本安全评价中心背景值或参考文献正常值范围内[5]，故这些变化无毒理学评价意义。给药末期，柴连感冒颗粒中、大剂量组T-CHO低于溶媒对照组，但柴连感冒颗粒中剂量组测定值在正常值范围内，柴连感冒颗粒大剂量组测定值略低于正常值范围，该变化可能为大剂量柴连感冒颗粒对雄性大鼠摄食量有短暂抑制作用而引起的动物营养不良所致，但恢复期可恢复正常。提示大剂量柴连感冒颗粒可能对脂代谢有可逆性影响。

脏器系数检查结果显示，连续给药31 d，柴连感冒颗粒大剂量组雌性大鼠胸腺系数低于溶媒对照组，停药14 d，柴连感冒颗粒小剂量组雌性大鼠子宫系数高于溶媒对照组，柴连感冒颗粒大剂量组雄性大鼠脑系数高于溶媒对照组，上述变化差异较小，且无明显剂量相关性，故与供试品无关。连续给药31 d，柴连感冒颗粒大剂量组肝系数和肾上腺系数高于溶媒对照组，结合血液生化和组织病理学检查结果，均未见相关组织异常改变，且停药后可恢复正常，故这些变化应无毒理学评价意义。

组织病理学检查结果显示，给药末期和恢复期各组个别脏器病变例数和病变程度无差异，考虑为大鼠的自发性病变，与柴连感冒颗粒无关，其余脏器未见异常。

综上所述，在本实验条件下，柴连感冒颗粒对大鼠重复灌胃给药31 d，45.0 g·kg-1时会导致雄性大鼠体质量增长减缓、给药初期摄食量减少，胆固醇降低，停药后逐渐恢复；柴连感冒颗粒对大鼠重复灌胃给药31 d无毒反应剂量为24.0 g·kg-1，相当于临床拟用剂量的28倍。