Eag1基因在人宫颈良恶性病变组织中的表达及其意义

张 兰,温路生,林月丽,邹双优,尹 晶,陈 慧*

(1厦门大学附属东南医院妇产科,漳州 363000;2厦门大学附属东南医院病理科;*通讯作者,E-mail:chenhui175@163.com)

宫颈癌(cervical cancer,CCa)是女性常见恶性肿瘤之一,病因尚未完全明确,大量的临床资料显示早婚、早育、多产及性生活紊乱等的妇女罹患宫颈癌的几率明显增高。目前宫颈癌病死率居于妇科恶性肿瘤的第2位,严重影响妇女的心身健康和生活质量[1]。因此,如何早期诊断、及时治疗宫颈癌具有重要的临床意义。近年来研究发现,电压门控型钾离子通道的亚型—Eag1通道仅在人脑组织中高表达,但却异常表达于如乳腺癌、卵巢癌、胃癌、结肠癌、软组织肉瘤等多种恶性肿瘤中并与这些肿瘤的发生和进展密切相关,已成为一个新兴的肿瘤分子治疗靶点[2-4]。目前关于Eag1基因与宫颈癌的研究较少,Eag1基因在宫颈癌中的表达、作用及意义尚不明确。本研究旨在探讨Eag1基因在不同宫颈病变组织中的表达情况,及与宫颈癌患者临床分期、预后的关系,为宫颈癌的靶向治疗提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 临床资料

随机选取(电脑随机选取此期间的宫颈癌患者ID号)2013-01～2018-01期间在解放军第一七五医院暨厦门大学附属东南医院妇产科诊治的共105例宫颈病变病例,所有标本最终均经本院病理科病理诊断证实。该研究由我院医学伦理研究委员会严格审查,患者被告知使用标本并在该研究前签署知情同意书。选取宫颈上皮内瘤变CIN 30例(其中CIN1级、2级、3级各10例),宫颈鳞癌45例(其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期各10例,Ⅳ期15例)。另取因子宫肌瘤等行全子宫切除的瘤旁正常宫颈组织病例30例。将每个样本平均分为两份,并在-70 ℃冷冻,一份用RT-PCR检测,另一份用4%甲醛固定,嵌入石蜡,切片厚度4 μm,最后进行免疫组织化学染色。

1.2 试剂与方法

Eag1抗体购自美国Thermo Fisher公司,按试剂盒说明书进行免疫组化操作。从美国的Santa Cruz公司购买了辣根过氧化物酶偶联山羊抗兔血色素抗体;从上海Sangon公司购买了ECL化学发光试剂盒。

1.3 免疫组化检测Eag1的蛋白表达

石蜡包埋组织连续切片(厚度4 μm),脱蜡,水化,PBS冲洗3×5 min后置于10 mmol/L柠檬酸缓冲(pH 6.0)中在高温和高压下修复抗原后。冷却至室温,再次用PBS冲洗3次。滴加一抗50 μl(兔抗人Eag1钾通道抗体,稀释浓度1 ∶200)在4 ℃下过夜。37 ℃复温45 min,PBS冲洗3次。DAB-H2O2孵育5-10 min(在显微镜下掌握染色程度),PBS冲洗10 min,苏木精染色,脱水,透明,封片。阴性对照组用PBS代替原抗体。阳性结果表明:1号钾通道蛋白的阳性表达为透明褐色,背景明显,位于细胞质和细胞膜中。统计标准参考文献[5]的方法,根据阳性细胞数和阳性染色强度,分为0,1,2,3分。0分为少于10%的细胞染色阳性,1分为大于10%的细胞呈弱阳性染色,2分为大于10%的细胞呈中等阳性染色,3分为大于10%的细胞呈强阳性染色。其中0分为阴性表达,1,2,3分为阳性表达。1分为弱阳性表达,2和3分为强阳性表达。

1.4 统计学分析

用SPSS 19.0统计软件进行统计分析。对所得数据进行了卡方检验和Fisher’s精确检验。P<0.05认为差异具有统计意义。

2 结果

2.1 Eag1在宫颈癌中的表达升高

30例子宫肌瘤正常宫颈组织中,2例Eag1为阳性表达(6.7%),其余均为阴性表达。30例宫颈上皮内瘤变标本中,3例CIN 3级标本中Eag1为阳性表达,3例CIN 2级标本中Eag1为阳性,2例CIN 1级标本中Eag1为阳性表达,阳性表达率为26.7%(见图1)。45例宫颈癌组织标本中,38例标本中Eag1为阳性表达,阳性表达率为84.4%(见图2)。与正常宫颈组织、宫颈上皮内瘤变组织相比,Eag1在宫颈癌组织的表达明显升高,差异具有统计学意义(P=0.030)。

2.2 Eag1在宫颈癌组织中的表达强度与临床分期有关

10例Ⅰ期的宫颈癌组织中,2例为Eag1阴性表达,4例为Eag1弱阳性表达,4例为Eag1强阳性表达,阳性表达率为80%,强阳性表达率为40%。10例Ⅱ期的宫颈癌组织中,1例为Eag1阴性表达,4例为Eag1弱阳性表达,5例为Eag1强阳性表达,阳性表达率为90%,强阳性表达率为50%。在10例Ⅲ期的宫颈癌组织中,Eag1的表达情况与其在Ⅱ期宫颈癌组织一样。15例Ⅳ期的宫颈癌组织中,Eag1均为阳性表达,其中3例为Eag1弱阳性表达,12例为强阳性表达,因此阳性表达率为100%,强阳性表达率为80%。Eag1在不同分期的宫颈癌组织中的阳性表达率无明显差异,但表达强度差异明显,具有统计学意义(P=0.011，见表1)。

图1 不同分级宫颈上皮内瘤变组织Eag1表达 (SP法,×100)Figure 1 Eag1 expression in cervical intraepithelial neoplasia tissues (SP,×100)

图2 不同分期宫颈鳞癌组织Eag1表达 (SP法,×100)Figure 2 Eag1 expression in cervical carcinoma tissues (SP,×100)

表1不同临床分期中Eag1的表达情况

Table1ExpressionofEag1incervicalcarcinomatissues

临床分期强阳性弱阳性阴性合计Ⅰ期44210Ⅱ期54110Ⅲ期54110Ⅳ期123015合计2615445

3 讨论

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,尤其在发展中国家的患病率更高。近年来随着社会的开放,过早性生活和性生活紊乱等原因,其发病率呈明显上升且年轻化趋势。宫颈癌起病较为隐匿,早期无明显特异性临床症状,故大多数患者会缺乏重视,因此在发现病情时已是临床中晚期。因此,我们急需寻找可以早期诊断并提示患者预后的生物学标志。

在细胞膜表面的众多离子通道中,钾离子通道的分布最广泛、家族规模最庞大[3]。细胞许多重要的生理病理过程,如细胞膜电位的形成、激素分泌、兴奋性、基因表达、细胞增殖和凋亡与钾离子通道密切相关。最近的研究发现,多种钾离子通道的亚族除了在细胞正常的生理活动中发挥重要作用,也参与了多种肿瘤细胞的增殖、周期、凋亡和侵袭等过程[4]。其中,Eag1是最受关注的一种亚族。Eag1最早发现于果蝇体内,它是电压门控型钾离子通道的成员之一,由EAG(ether à go-go)基因编码。进一步的研究发现,在正常人体组织中,Eag1在脑组织中高度表达,在胎盘中少量表达,并在肌细胞中短暂表达。但是Eag1在多种人类肿瘤细胞和组织中高度表达,且参与了肿瘤细胞增殖、细胞周期等过程[5,6]。之后的研究证实:Eag1可能受miR-296-3p[7]、miR-155[8]、miR-34a[9]等的调控。此外,它还有助于恶性细胞的生长和癌前病变的恶性转化[10]。进一步的研究表明,Eag1的表达水平与肿瘤大小、转移、分期、浸润深度等有关,可提示恶性肿瘤患者的临床预后[11]。因此,Eag1已成为一个明确的癌基因,但其在宫颈癌中的作用和可能的机制尚不明确。

本研究中,Eag1在宫颈癌组织的表达阳性率明显高于正常宫颈组织和宫颈上皮内瘤变组织,提示Eag1可能与宫颈癌的发生有一定的关联。而在45例宫颈癌组织标本中,Eag1阳性表达率高于80%,且大部分为强表达。进一步研究表明:临床分期越高,Eag1的表达强度越高,提示Eag1与宫颈癌患者的预后有关。

综上所述,在临床病理分期较高的病例中,Eag1的高阳性表达率证实了Eag1可能参与了宫颈癌发展的过程,而且宫颈癌患者Eag1表达水平与临床预后有显著相关性。检测宫颈病变中的Eag1蛋白可作为判断患者是否存在潜在的恶性危险的依据。但上述研究仍存在不足,在接下来的研究中我们将检测Eag1在宫颈癌细胞中的表达和作用并绘制不同病理分期宫颈癌患者的生存曲线以进一步证实上述结论。