耐恩诺沙星沙门菌gyrA和gyrB基因的分子特征分析

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(河南牧业经济学院，河南 郑州 450046)

沙门菌(Salmonella)是人畜共患病原菌，兽医临床常选用喹诺酮类药物作为治疗沙门菌感染的常规用药之一。恩诺沙星是化学合成的第3代喹诺酮类动物专用抗菌药，在兽医领域应用广泛。但由于临床的不合理使用，沙门菌对恩诺沙星的耐药现象在国内外频频被报道，且耐药率和耐药程度呈逐渐上升趋势[1-3]。

喹诺酮类药物主要是通过选择性抑制细菌的DNA螺旋酶和拓扑异构酶Ⅳ来发挥抗菌作用，其中DNA螺旋酶是喹诺酮类药物作用的首要靶位，包括A亚单位和B亚单位，分别由gyrA基因和gyrB基因编码。研究发现，这些基因的突变可导致细菌DNA螺旋酶结构改变，从而使喹诺酮类药物失去原来的作用靶点。有报道称，gyrA基因的第67—106位氨基酸突变决定着沙门菌的耐药性[4-6]，但突变位点在不同研究结果中不尽相同[7-8]，因此，进一步探索和证实沙门菌gyrA和gyrB基因中影响喹诺酮类药物耐药性的具体突变位点，对于研究沙门菌对喹诺酮类药物的耐药机制是十分必要的。本研究从2016—2017年兽医临床分离的18株沙门菌中检测耐恩诺沙星的菌株，一方面调查目前兽医临床沙门菌对恩诺沙星的耐药程度，另一方面分析耐药菌gyrA和gryB基因的分子特征，以进一步阐明沙门菌对喹诺酮类药物的耐药机制。

1 材料和方法

1.1 菌种复苏

18株沙门菌于2016—2017年分离自河南省不同地区畜禽养殖场，其中10株为鸡源沙门菌，8株为猪源沙门菌。取保存菌种，按1∶100比例无菌接种于LB肉汤中，37 ℃振荡培养12～18 h，用接种环无菌挑取菌液划线接种于LB琼脂平板上，37 ℃温箱倒置培养12～18 h，后挑选单个菌落接种于LB肉汤，37 ℃振荡培养12 h后，保存备用。

1.2 主要试剂和药品

LB肉汤、MH肉汤、SS琼脂培养基均购自北京奥博星生物技术有限责任公司；DNA聚合酶(2×TaqPCR MasterMix)、EB核酸染料、DL2000 DNA Marker均购自北京索莱宝科技有限公司；琼脂糖和TAE缓冲液均购自天根生物科技有限公司；恩诺沙星为河南牧业经济学院药理学实验室保存的科研专用原料药，均在使用有效期内。

1.3 恩诺沙星对耐药菌株最小抑菌浓度(MIC)的测定

采用美国临床实验室标准化研究所(CLSI)推荐的微量肉汤稀释法[9]测定恩诺沙星对18株兽医临床分离沙门菌的MIC，选择大肠杆菌ATCC®25922作为质控菌。

1.4 恩诺沙星耐药菌株gyrA和gyrB基因的扩增

1.4.1 菌株基因组DNA提取及PCR引物序列 选择对恩诺沙星耐药的菌株，采用煮沸法提取耐药菌株的基因组DNA。PCR引物序列及扩增片段长度见表1，引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 恩诺沙星耐药菌株gyrA和gyrB基因扩增引物

1.4.2 恩诺沙星耐药菌株gyrA和gyrB基因的PCR扩增 以基因组DNA为模板，用上述引物进行PCR扩增。采用25.0 μL的PCR反应体系：基因组DNA 2.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA聚合酶12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循环30次；最后72 ℃延伸20 min，于16 ℃保存20 min。将扩增产物置于1.0%的琼脂糖凝胶中进行电泳，在紫外凝胶成像系统下观察结果。

1.4.3 PCR产物测序及序列分析 将扩增所得gyrA和gyrB基因的PCR产物送至深圳华大基因股份有限公司进行测序，利用DNAMAN软件将测序结果与NCBI上公布的沙门菌标准菌株(LT2株)的gyrA和gyrB基因序列进行比对，分析耐药菌株gyrA和gyrB基因突变情况。

2 结果与分析

2.1 恩诺沙星对耐药菌株MIC测定结果

根据CLSI推荐的标准，把MIC≤0.500 μg/mL和MIC≥4.000 μg/mL分别作为判断菌株对喹诺酮类药物敏感和耐药的依据。MIC的测定结果见表2，18株兽医临床分离的沙门菌中有11株为敏感菌株，MIC≤0.500 μg/mL；耐药菌为4株(菌株编号分别为2891、1815、9660、SH40)，MIC≥4.000 μg/mL，耐药率为22.2%；另有3株处于中介状态，MIC在0.500～4.000 μg/mL。由此可见，沙门菌已产生了普遍且较强的恩诺沙星抗性，高度耐药菌2891株的恩诺沙星MIC达到敏感菌株的128倍以上。

表2 恩诺沙星对18株沙门菌株的MIC值

注：MIC≤0.500 μg/mL为敏感(S)；0.500≤MIC≤4.000 μg/mL为中介(I)；MIC≥4.000 μg/mL为耐药(R)。

Note：MIC≤0.500 μg/mL is sensitive(S);0.500≤MIC≤4.000 μg/mL is intermediary(I);MIC≥4.000 μg/mL is resistant(R).

2.2 恩诺沙星耐药菌株gyrA和gyrB基因的PCR扩增结果

对4株恩诺沙星耐药菌株(2891、1815、9660、SH40)进行gyrA和gyrB基因扩增，均得到625 bp和498 bp的目的条带，与预期大小一致，如图1所示。

2.3 恩诺沙星耐药菌株gyrA和gyrB基因的序列分析结果

将4株恩诺沙星耐药菌株(2891、1815、9660、SH40)的gyrA和gyrB基因编码的氨基酸序列与标准野生型菌株(LT2)进行比对发现，gyrB基因没有发生突变，而gyrA基因存在位点突变。如表3所示，在gyrA基因的喹诺酮耐药区(QRDR)内(第67—106个氨基酸)存在2个位点突变，分别是Ser83→Phe或Leu，突变率达100%；Asp87→Asn，突变率75%。在非QDRD存在1个突变位点，Asn200→Asp，突变率为25%。分析不同菌株的突变情况，发现恩诺沙星MIC≥16.000 μg/mL的3株菌均是在83、87位出现双突变(Ser83→Phe、Asp87→Asn)，而恩诺沙星MIC为4.000 μg/mL的1株菌则是在83、200位出现双突变(Ser83→Leu、Asn200→Asp)。

M：DL2000 DNA Marker； 1：阳性对照； 2—5：耐药菌株2891、1815、9660、SH40； 6：阴性对照

菌株StrainsgyrA基因突变位点gyrA gene mutation sitegyrB基因突变位点gyrB gene mutation siteMIC/(μg/mL)LT2NoneNone0.0042891Ser83→Phe、Asp87→AsnNone64.0001815Ser83→Phe、Asp87→AsnNone16.0009660Ser83→Phe、Asp87→AsnNone16.000SH40Ser83→Leu、Asn200→AspNone4.000

注：None表示未检测出突变位点。

Note：None indicates that no mutation site was detected.

3 结论与讨论

随着细菌对喹诺酮类药物耐药现象被频频报道，临床耐药菌株的检测和耐药机制的研究也不断深入[10-12]。本研究从18株兽医临床分离的沙门菌中共检测出4株恩诺沙星耐药菌株，其中耐药程度最强菌株的恩诺沙星MIC达到64.000 μg/mL，可见目前已出现对恩诺沙星高度耐药的沙门菌，这对临床防治沙门菌感染带来了巨大的挑战，同时也提醒兽医工作者们要注重临床合理用药。

关于喹诺酮类药物的耐药机制，众多研究证实，药物作用靶位基因分子特征的改变与耐药性的产生密切相关[13]。QRDR的基因突变被认为是最主要的耐药机制[14]，gyrA基因的点突变主要集中于第67—106位氨基酸[15]，然而不同种属的细菌突变位点和突变情况存在差异。有研究显示，结核分枝杆菌gyrA基因的90、91、94位点突变与其对喹诺酮类药物耐药的产生密切相关[16]。大肠杆菌中，有研究表明，gyrA基因的QRDR有义突变常发生在81、82、83、84、87、106位氨基酸的编码基因，单位点突变以83位的Ser→Leu最常见，双位点突变有83、87位氨基酸突变[17-18]。在铜绿假单胞菌的研究中显示，对环丙沙星和左氧氟沙星耐药主要是由于gyrA与gyrB基因的突变以及外排泵mexAB-OprM与mexCD-OprJ表达增加共同作用的结果[19]。本研究通过分析耐恩诺沙星沙门菌的gyrA和gyrB基因的分子特征发现，gyrB基因未发现突变位点，与李珂婷[20]用5种喹诺酮类药物诱导培养沙门菌后其gyrB、parC及parE基因均未发生突变相似，但gyrA基因在83、87、200位氨基酸出现了位点突变，其中突变频率最高的是83位氨基酸(Ser83→Phe或Leu)，以Ser→Phe最多。4株恩诺沙星耐药沙门菌中，耐药程度较强的菌株均是在氨基酸的83位(Ser83→Phe)和87位(Asp→Asn)出现双突变，而耐药程度相对较弱的菌株是在83位(Ser83→Leu)和200位(Asn→Asp)出现双突变，因此提示gyrA基因QRDR区(第67—106位氨基酸)的双突变可使沙门菌对恩诺沙星的耐药性增强，推测原因可能是Asp87的突变可能增强了Ser83位点突变所介导的耐药性，而非QRDR的Asn200不能发挥增强耐药性的作用，但此推断仍需进一步研究来证实。