Rab26对小细胞肺癌H446细胞增殖和迁移的影响

陈 伟 李 华 唐心蔚 刘雪萍

支气管肺癌是严重威胁人类健康的常见疾病，在恶性肿瘤中，发病率和死亡率占居首位[1]。目前经过手术和传统的化疗及放疗肺癌仍难以控制，且副作用大，五年生存率仅为15%～20%[2]。小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)是肺癌中重要的病理类型，占肺癌的15%～20%，恶性程度较高，虽然其对化疗敏感性较高，但是由于分化差、增殖快且极易发生转移，导致对药物易产生耐药性[3]。因此，寻找新的治疗途径和靶标，是小细胞肺癌治疗的关键。Rab26是Rab家族近年来新发现的成员，主要参与细胞的黏附、运动、分裂和基因转录[4]。既往研究表明，Rab26可以促进肿瘤细胞凋亡，并抑制其迁移[5]，在对抗肿瘤的生长发展中有着重要作用，但是在小细胞肺癌中的研究尚无报道。因此，本文以Rab26过表达质粒载体和siRNA序列作用小细胞肺癌H446细胞，观察Rab26对H446细胞增殖及细胞迁移的影响，旨在为小细胞肺癌的防治提供新的治疗靶点。

材料与方法

一、实验材料

Rab26过表达质粒(pDsRed monomer C1载体)和siRNA(序列：GUGUUA- CCCAUGCCUACUATT UAGUAGGCAUGGGUAACACTT，Cy3标记)由生工构建，1649完全培养基、OptiMEM、胰蛋白酶购自HyClone公司(美国)，转染试剂购自罗氏公司，RNA提取试剂、RT-PCR试剂盒、质粒提取试剂盒购自北京天根生物技术公司，Rab26、GAPDH抗体购于艾博抗贸易有限公司。

二、实验方法

1. H446细胞的培养: H446细胞置于37 ℃、含5% CO2的1 640培养基(含5%标准胎牛血清)的培养箱中培养。每次实验所需细胞均选择对数生长期的细胞。

2. 细胞转染: 实验分为对照细胞组、Rab26质粒过表达组、Rab26siRNA组。接种H446细胞接种于6孔板了培养1 d(1×105个/孔)，显微镜下观察肿瘤细胞生长融合情况，待肿瘤细胞达60%的融合率时进行转染，且在进行细胞转染时先用PBS洗涤6孔板，更换培养基为Opti-MEM，同时分别将质粒、siRNA与转染试剂按照比例稀释(参照说明书)，对照组则加入等量稀释液培养液。6 h后更换为完全培养基，置于细胞培养箱中继续培养。

3. 流式细胞仪检测转染效率: 0.25%的胰酶处理转染后的H446细胞，以离心半径8 cm，2 000 r/min 离心10 min，弃上清，PBS洗涤细胞2次，加入300 μl PBS重悬细胞，混匀，待流式细胞仪检测。

4. RT-PCR检测Rab26 mRNA的表达: Trizol提取总RNA，Rab26引物上游: 5′-TCAAGGGCGGCAGCAGGA-3′，下游: 5′-GAGTACGCCCAGCACGAC-3′；GAPDH引物上游: 5′-GCAAATTCCAC GGCACAGTCA-3′，引物下游: 5′-TCACGCCACAGTTTCCCAGAG-3′。按照RT-PCR 试剂盒进行逆转录，其中Rab26 扩增长度为298 bp，GAPDH扩增长度为450 bp，条件参照既往文献[5]。

5. Western blot 检测Rab26蛋白的表达: 提取总蛋白，4 ℃，以离心半径8 cm，12 000 r/min 离心10 min，检测总蛋白浓度，按需要调蛋白浓度，向蛋白液中加入Loading buffer，煮沸8 min变性。配制分离胶、浓缩胶，SDS-PAGE凝胶电泳，80 V 40 min，120 V 1.0 h后，350 mA转膜45 min，将PVDF膜封闭2 h后，加入一抗4 ℃孵育过夜；第二天TBST漂洗至少3次，每次10 min，孵二抗1 h，TBST漂洗后显色。

6. MTT检测H446细胞增殖: H446细胞接种于96孔板内(1×103/孔)，加入200 μl培养液，各组设4个复孔，置于培养箱内培养24 h，再进行细胞转染，分别于转染后24 h和48 h后，向每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，再培养4 h后，弃上清液，加入150 μl 二甲基亚砜(DMSO)，混匀。490 nm波长下测定细胞生长活力，计算光密度值。细胞生长活力=[实验组光密度值/对照组48 h光密度值]× 100%。

7. 划痕实验检测H446细胞迁移: H446细胞接种于6孔板内(1×105/孔)，待细胞在孔内融合率达100%后，用tip头在6孔板中央画直线。并用PBS洗涤1次，继续加入10%FBS的1 640完全培养基，同时显微镜下照相记录0 h位置；24 h后，更换培养基后照相，观察各组肿瘤细胞迁移情况；48 h，重复观察。

常用的混合材有：火山灰、粉煤灰、粒化高炉矿渣、煤矸石、沸石、石灰石、石英岩、炉渣、硅锰渣、硫酸铝渣等。有些材料的内比表面积大，如沸石、硫酸铝渣吸水量大，炉渣、矿渣呈多孔结构，这些材料与外加剂的相容性均较差。

三、统计学方法

使用SPSS 15.0 for windows 和Image-Pro Plus 10.0对数据和图像进行分析，每组别至少重复3次实验，两组间比较采用t检验方法，P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、Rab26过表达质粒和siRNA转染H446细胞转染效率

各组转染48 h后，Rab26质粒过表达组转染效率达(76.8±4.3)%；siRNA组转染效率为(79.5±3.57)%，见图1，结果表明转染效率较高，为后续实验提供较好的数据支撑。

图1 各组转染H446细胞的转染效率

二、Rab26在基因和蛋白水平的改变

转染48 h后，检测每组Rab26在mRNA和蛋白水平的表达情况，发现质粒过表达组Rab26 mRNA和蛋白表达较对照组显著增加(P<0.05)，而Rab26 siRNA组在mRNA和蛋白水平表达较对照组表达均显著减少(P<0.05)，见图2。结果表明为有效转染，在基因和蛋白水平都发挥效应。

图2 各组间Rab26mRNA和蛋白表达；注： *:P<0.05，与正常组比较

三、Rab26对H446细胞增殖的影响

图3 各组细胞存活率；注：*:P<0.05，与对照24 h比较；#：P<0.05，与对照48 h比较

四、Rab26对H446细胞迁移的影响

划痕实验结果显示对照组、质粒过表达组、siRNA组转染24 h后，迁移速度分别为(0.53±0.03)μm/min、(0.21±0.04)μm/min、(0.61±0.02)μm/min；转染48 h后各组迁移速度分别为(0.32±0.04)μm/min、(0.22±0.04)μm/min、(0.42±0.03)μm/min，在24、48 h时过表达组细胞迁移速度显著低于对照组(P<0.05)，siRNA组在24、48 h时迁移速度则显著高于对照组，见图4。

讨论

近年来肺癌的发生呈逐年上升趋势，且呈年轻化，严重影响人们的生活质量。尤其是随着我国经济的快速发展，环境污染导致的雾霾天气在全国各地出现的频率亦越来越高，也引发肺癌的发病率和死亡率日趋增加，约2/3的患者在诊断时发现已出现远处转移。目前小细胞肺癌的治疗手段主要是化疗及放疗，尽管近年来其治疗策略也处于不断探索和发展中，一定程度上提高了小细胞肺癌治疗的缓解率，但是对改善患者的生存期仍是极为有限。据统计，广泛期和局限期小细胞肺癌的5年生存率仅有2%和10%，且局限期患者的中位生存时间仅为18～20个月，广泛期患者的中位生存时间则仅有8～12个月[6-7]。因此，亟待探索新的治疗策略以提高肺癌患者的生存期和生活质量。

研究表明肺癌的发生发展受多因子、多因素、多阶段控制，其中癌细胞的增殖和凋亡失衡，以及早期的转移是癌症发生的重要原因[8]，其中增殖和转移为恶性肿瘤的最主要特征。已知肿瘤细胞的增殖能力增强主要由于细胞的增殖失控所致，因此抑制肿瘤细胞的生长和繁殖是控制肿瘤增殖的关键； 而肿瘤迁移的过程主要包括肿瘤细胞的极化以及伪足生成，进而伪足与细胞外基质的黏附，导致细胞体收缩、周期基质和细胞尾端解离，最终引起肿瘤细胞向前运动，同时肿瘤侵袭和转移亦是导致肺癌患者预后不良，5年生存率低的主要原因[9-11]。Rab26属于Ras超家族，首次被发现于小鼠胰腺细胞中，其调控胰腺细胞中溶酶体的释放[12-14]。后期研究又发现其可以通过激活MIST1调节溶酶体的转运，并参与细胞内的囊泡运输，在细胞囊泡内顺式转运中发挥重要作用[15-17]。既往研究表明Rab26除了参与细胞的囊泡运输，介导细胞内受体的转运之外，在细胞的凋亡、自噬、迁移等生命进程也扮演了重要角色[18-22]。

图4 各组细胞迁移情况

本文结果发现Rab26在H446细胞中有表达，且通过转染过表达质粒、siRNA的作用可调控Rab26 在mRNA和蛋白水平的表达变化，提示Rab26可能在肺癌细胞的发展进程中有重要作用。在进一步的实验中发现转染Rab26过表达质粒后H446细胞的增殖减弱，而转染Rab26 siRNA后则促进了H446细胞的增殖，表明Rab26可以抑制H446细胞的增殖；本实验结果还显示Rab26过表达质粒组细胞的迁移也显著受到抑制，Rab26 siRNA组则加速了H446细胞的迁移能力，表明Rab26可有效抑制H446细胞的迁移，提示Rab26在调控H446细胞的增殖和迁移能力中有重要作用，其有望作为小细胞肺癌细胞的一个潜在靶点。

鉴于细胞增殖和转移在肿瘤的发生、发展中的重要作用，因此通过抑制肿瘤细胞的增殖和迁移则成为肿瘤治疗的重要方向。我们的实验证实了Rab26在小细胞肺癌中伴有重要角色，早期的研究表明，Rab家族其他成员与肿瘤的迁移和侵袭有密切关系。目前已发现Rab5参与肺癌的侵袭和转移，可降低肿瘤细胞分化性并促进侵袭转移的能力[23-25]；Rab39和Rab21参与肿瘤细胞中胞内定位及内涵体的转运，同时促使肿瘤的侵袭和黏附[26-27]；Rab25和Rab8与胃癌细胞的迁移、侵袭密切相关[28-29]；Rab11和Rab13参与肿瘤细胞伪足的形成，进而调控肿瘤的转移侵袭[30-31]。可见，除Rab26 以外，其他Rab蛋白在肿瘤的发生发展中也发挥了重要作用，并进一步影响细胞的增殖、分化、凋亡，进而决定细胞的生命进程[32]。因此，结合Rab蛋白的囊泡转运作用，研究Rab蛋白在肿瘤中的作用和机制可为肺癌患者的治疗提供新的思路。