白藜芦醇诱导小细胞肺癌H446细胞凋亡机制的研究

李王平 马李杰 潘 蕾 金发光

白藜芦醇是广泛存在于自然界的一种多酚类化合物，具有很强的生物活性[1-4]。多项研究发现，白藜芦醇对多种恶性肿瘤细胞均有明显的抑制作用，主要机制为抑制蛋白质-酪氨酸激酶的活性、抑制癌细胞增殖，诱导癌细胞分化、凋亡等[5-8]。小细胞肺癌恶性程度高，倍增时间短，转移早而广泛，虽然对化疗、放疗敏感，初治缓解率高，但极易发生继发性耐药，容易复发，截止目前，小细胞肺癌的治疗方法仍以放化疗为主。小细胞肺癌的治疗效果在过去的几十年中没有明显改善，对于小细胞肺癌靶向治疗及免疫治疗的相关研究较为滞后[9-13]。虽然已有一些针对小细胞肺癌靶向治疗的临床实验，但目前尚未有明确的疗效报道，部分患者使用免疫调节剂，但疗效欠佳[14-15]。本文拟探讨白藜芦醇对人小细胞肺癌H446细胞增殖的抑制作用及诱导H446细胞凋亡的作用及可能的机制，旨在为小细胞肺癌化疗治疗提供理论基础。

材料和方法

一、实验材料

人小细胞肺癌H446细胞由第四军医大学唐都医院呼吸内科实验室提供。FBS培养基、RPMI1640培养基、RPMI1640培养基购自美国Hyclone公司，MTT、白藜芦醇购自Sigma 公司，DMSO 购自Invitrogen 公司，胎牛血清、胰蛋白酶购自Gibco公司，AV/PI染料购自碧云天生物技术公司，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(BD)。主要仪器设备：细胞培养箱(美国热电公司)，光学显微镜、倒置拍摄显微镜(蔡司公司)，低速离心机(湘仪)，酶标检测仪(赛默飞)，流式细胞仪(BD)，DHE荧光探针(碧云天生物技术公司)，JC-10膜电位探针(ab112133)。

二、研究方法

1. 细胞培养： 观察细胞生长情况，进行传代扩增。观察细胞状态良好，细胞生长密度80%～90%，可以进行传代；将培养皿中原有培养液弃去，用PBS洗2次； 加入0.25%的胰酶消化细胞，在显微镜下观察细胞消化情况，待细胞变圆后吸去胰酶； 加入完全培养基终止消化，将细胞吹打为单细胞悬液；将细胞按照一定比例进行分离，加入适量的完全培养液培养，37 ℃，5% CO2培养箱中；每天观察细胞状态，扩增到足够的细胞量后开始实验，一般2 d可传一代。

2. MTT检测

(1)白藜芦醇的细胞毒性观察及实验浓度筛选： 将处于对数生长期时的细胞，以5×104cells/ml密度接种到96孔细胞培养板，每孔150 μl，每个浓度梯度3个复孔，37 ℃，5% CO2培养；将白藜芦醇分别用完全培养基稀释至20 μg/ml，30 μg/ml，40 μg/ml，50 μg/ml，60 μg/ml，70 μg/ml，80 μg/ml，90 μg/ml，100 μg/ml，110 μg/ml和120 μg/ml按照实验分组给药处理，以CK、DMSO作为对照；培养24 h后在每孔加入15 μl的MTT，37 ℃，5% CO2培养箱内避光孵育3～4 h；弃上清，加入200 μl的DMSO，室温摇床震荡10 min；酶标仪492 nm波长测出同一时间点OD值，用测得的OD值进行细胞增殖影响的分析。

(2) 根据前期浓度筛选结果进一步观察白藜芦醇的细胞毒性作用特点： 将处于对数生长期时的细胞，以5×104cells/ml密度接种到96孔细胞培养板，每孔150 μl，每个浓度梯度3个复孔，37 ℃，5% CO2培养；实验分组1：将白藜芦醇分别用完全培养基稀释至20 μg/ml，30 μg/ml，40 μg/ml，给药处理，设空白对照，孵育24 h；实验分组2：将白藜芦醇用完全培养基稀释至30 μg/ml，给药处理，分别培养12 h，24 h和48 h，设空白对照；每孔加入15 μl的MTT，37 ℃，5% CO2培养箱内避光孵育3～4 h；弃上清，加入200 μl的DMSO，室温摇床震荡10 min；酶标仪492 nm波长测出同一时间点OD值，用测得的OD值进行细胞增殖影响的分析。

3. 流式检测细胞凋亡、细胞内ROS及线粒体膜电位： 取对数生长期细胞，以细胞密度为1×105个/ml接种于6孔板中，每孔3 ml，于37 ℃，5% CO2培养箱中培养；实验分组1：将白藜芦醇分别用完全培养基稀释至20 μg/ml，30 μg/ml，40 μg/ml，设空白对照，给药处理24 h；实验分组2：将白藜芦醇用完全培养基稀释至30 μg/ml，给药处理，分别培养12 h，24 h和48 h，设空白对照；实验分组：分别用不含EDTA的胰酶消化收集细胞后，以离心半径8 cm，1 500 r/min离心5 min，然后收集细胞；用预冷的1×PBS(4 ℃)重悬细胞，以离心半径8 cm，1 500 r/min离心5 min，洗涤细胞，然后加入300 μl的1×Binding Buffer悬浮细胞；加入5 μl的Annexin V-FITC并混匀，避光室温孵育15 min。加入10 μl的PI染色，混匀细胞，继续避光孵育10 min；用PBS重悬细胞，上流式细胞仪检测。

4. 流式检测ROS： 取对数生长期细胞，以细胞密度为1×105个/ml接种于6孔板中，每孔3 ml，于37 ℃，5% CO2培养箱中培养；实验分组1：将白藜芦醇分别用完全培养基稀释至20 μg/ml，30 μg/ml，40 μg/ml，设空白对照，给药处理24 h；实验分组2：将白藜芦醇用完全培养基稀释至30 μg/ml，给药处理，分别培养3、6、12、24 h，设空白对照；分别用胰酶消化收集以上各实验组细胞后，以离心半径8 cm，1 500 r/min离心5 min；用PBS清洗细胞，加入DHE荧光染料，37 ℃下避光孵育30 min；PBS重悬细胞后上流式细胞仪进行ROS检测。

5. 流式检测线粒体膜电位： 取对数生长期细胞，以细胞密度为1×105个/ml接种于6孔板中，每孔3 ml，于37 ℃，5% CO2培养箱中培养；实验分组1：将白藜芦醇分别用完全培养基稀释至20 μg/ml，30 μg/ml，40 μg/ml，设空白对照，给药处理24 h；实验分组2：将白藜芦醇用完全培养基稀释至30 μg/ml，给药处理。分别培养3、6、12、24 h，设空白对照；用胰酶消化收集以上各实验组细胞后，以离心半径8 cm，1 500 r/min离心5 min；用PBS清洗细胞，加入JC-10荧光染料，37 ℃避光孵育45 min；PBS重悬细胞后上流式细胞仪进行JC-10检测。

三、统计学方法

结 果

一、白藜芦醇对H446细胞的毒性观察及MTT检测结果

1. 白藜芦醇作用于H446细胞后形态学变化： 白藜芦醇给药后，观察发现不同浓度的白藜芦醇可造成不同比例的细胞死亡，随着药物浓度增加，细胞死亡增多。细胞死亡后，出现细胞圆缩，失去原有形态，细胞不贴壁。在光镜下(100×)可以观察到细胞变得不透亮，失去活性，随着浓度增加，异常细胞明显增多。而对照组细胞形态正常，表现为细胞形态展开，细胞透亮，细胞状态良好，细胞活性高，见图1。

2. MTT检测不同浓度白藜芦醇对H446细胞增殖的抑制作用： MTT检测发现，白藜芦醇从30 μg/ml浓度开始，H446细胞增殖出现明显抑制，40 μg/ml时细胞抑制率迅速上升，且随着给药浓度增加，其抑制率增加，到达一定浓度后其细胞抑制率不再上升，与对照组相比差异均有统计学意义，P<0.01，见图2。

图2 不同浓度白藜芦醇对H446细胞的抑制率

3. 白藜芦醇对H446细胞增殖抑制作用的特点观察

(1)白藜芦醇不同浓度下及作用不同时间后细胞形态变化：从形态学变化可以看出，随着白藜芦醇浓度增加和白藜芦醇作用时间的延长，受损细胞数增多，受损程度变重，光镜下可观察到细胞形态不贴壁，圆缩，透亮度变低，异常细胞数目随着作用浓度和作用时间的增加而增多，见图3、4。

(2)MTT检测白藜芦醇不同浓度下及作用不同时间后对H446细胞增殖的抑制作用： 实验结果表明，与CK相比较，Res在30 μg/ml时开始产生细胞抑制，40 μg/ml时其抑制率显著上升，差异有统计学意义(P<0.01)，说明Res的细胞毒性作用有浓度依赖的特点；而作用不同时间细胞抑制率结果显示，随着作用时间的延长，细胞抑制率增加，在作用24 h时产生明显抑制，作用48 h时抑制率接近70 %，差异有统计学意义，P<0.01，说明Res的细胞抑制有时间依赖的特点，见图5。

图1 白藜芦醇作用于H446细胞后的形态学变化(100×)；注：A：100～120 μg/ml浓度，细胞完全死亡；B：70～90 μg/ml浓度，大部分细胞出现圆缩，失去原有形态，细胞不贴壁；C：40～60 μg/ml浓度，50%以上细胞不透亮，失去活性；D：20～30 μg/ml大部分细胞状态良好，CK组细胞形态展开，透亮，细胞状态良好，活性高；E：DSMO组大部分细胞状态良好

图3 不同浓度白藜芦醇作用时细胞形态变化(100×)

图4 30 μg/ml白藜芦醇作用不同时间后细胞形态变化(100×)

图5 不同浓度白藜芦醇及作用不同时间(30 μg/ml)细胞抑制率

二、流式检测细胞凋亡

1. 不同浓度白藜芦醇作用后H446细胞凋亡变化： 流式检测结果显示，与CK组相比，不同浓度白藜芦醇诱导的细胞凋亡程度不同，随着白藜芦醇给药浓度的增加，细胞凋亡数量显著增加，在40 μg/ml时凋亡比例增加显著，差异有统计学意义(P<0.01)，见图6、7。

图6 不同浓度白藜芦醇流式检测的细胞凋亡变化

图7 不同浓度白藜芦醇致H446细胞凋亡率

凋亡检测结果说明白藜芦醇诱导的细胞凋亡与浓度相关，具有浓度依赖性的特点。

2. 白藜芦醇作用不同时间H446细胞凋亡变化： 流式检测结果发现，与CK组相比，给药时间不同，导致的细胞凋亡程度不同。作用24 h后，细胞凋亡比例显著上升，作用48 h后凋亡比例超过50%，说明随着给药时间的延长，细胞凋亡数量增多，凋亡率增加，Res的促细胞凋亡作用有时间依赖性特点，差异有统计学意义(P<0.01)，见图8、9。

三、流式细胞仪检测ROS

1. 不同浓度白藜芦醇作用后细胞内ROS释放变化： 流式细胞仪荧光测量结果显示，随着白藜芦醇浓度增加，细胞内ROS释放增多。40 μg/ml 浓度时ROS释放量显著增多，说明ROS释放有浓度依赖性，差异有统计学意义，(P<0.01)，见图10、11。

图8 30 μg/ml白藜芦醇作用不同时间流式检测的细胞凋亡变化

图9 30 μg/ml 白藜芦醇作用不同时间H446细胞凋亡率

图10 不同浓度白藜芦醇给药时细胞内ROS释放情况

图11 不同浓度白藜芦醇给药时细胞内ROS释放量

2. 白藜芦醇给药不同时间细胞内ROS释放变化： 由流式检测结果可以看出，在Res给药后细胞内ROS逐渐释放，随着白藜芦醇给药时间延长，细胞内ROS释放量逐渐增多，细胞ROS释放有时间依赖性，差异有统计学意义(P<0.01)，见图12、13。

图12 30 μg/ml 白藜芦醇给药不同时间细胞内ROS释放情况

图13 30 μg/ml白藜芦醇给药不同时间细胞内ROS释放量

四、流式细胞仪检测线粒体膜电位

1. 不同浓度白藜芦醇给药后线粒体膜电位变化： 流式细胞仪检测结果显示，与CK组相比，白藜芦醇给药浓度不同，线粒体膜电位的下降程度也不同，随着浓度的增加，下降程度增加，白藜芦醇浓度40 μg/ml 时线粒体膜电位下降最为显著，有浓度依赖的特点。即随着浓度的增加，线粒体膜电位下降增加，差异有统计学意义(P<0.01)，见图14、15。

图14 不同浓度白藜芦醇给药后线粒体膜电位变化

图15 不同浓度白藜芦醇给药后线粒体膜电位下降率

2. 流式细胞仪检测白藜芦醇作用不同时间线粒体膜电位变化： 流式结果显示，与CK组相比，随着白藜芦醇给药时间的延长，线粒体膜电位下降更加明显，给药24 h下降最为明显，呈现时间依赖性，差异有统计学意义(P<0.01)，见图16、17。

讨论

白藜芦醇是一种多酚类化合物，主要来源于花生 、葡萄(红葡萄酒)、虎杖、桑椹等植物，具有很强的生物活性，近年来因其由于具有防癌及抗癌作用备受研究关注[16]。研究显示白藜芦醇对众多的肿瘤具有体外细胞毒性效应，包括骨髓瘤、淋巴瘤、乳腺癌、皮肤癌、宫颈癌、卵巢癌、胃癌、前列癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、甲状腺癌等[17-19]。研究表明白藜芦醇的抗增殖活性与刺激癌细胞凋亡有关[20-23]。有人提出，细胞凋亡的激活可能是化疗药物破坏癌细胞的一种可能机制[24]。在很多人体肿瘤中，细胞凋亡受损，说明细胞凋亡功能的破坏是正常细胞转化为肿瘤细胞的重要因素[25]。

图16 30 μg/ml 白藜芦醇给药不同时间线粒体膜电位变化

图17 30 μg/ml 白藜芦醇给药不同时间线粒体膜电位下降率

本文先采用了浓度筛选的方法，即通过不同浓度的白藜芦醇作用于H446细胞，观察其毒性作用变化与药物浓度之间的关系。细胞毒性研究结果提示，白藜芦醇作用于H446细胞后，细胞形态学发生了明显变化，而且不同的浓度造成的损伤程度不同，在细胞培养中出现了不同比例的细胞死亡。 根据浓度梯度观察结果，选择30 μg/ml白藜芦醇进一步观察其对H446细胞的毒性作用特点，观察其毒性作用是否与作用时间有相关性。研究结果显示，随着白藜芦醇作用时间的增加，受损细胞变多，受损程度变重。MTT检测结果提示白藜芦醇可对H446细胞增殖产生抑制，其抑制率随浓度、时间而增加，抑制率增加的特点，表现为浓度和时间依赖，并与细胞形态学观察结果相符。

线粒体是人体供能物质产生的最主要场所，ATP生成的任一过程受阻，氧化呼吸链电子功能传递障碍，都会导致细胞供能和组织代谢发生异常，导致机体发生异常[26]。肿瘤细胞由于其线粒体结构和功能异常，因此不能发挥正常的产能功能，其代谢会发生紊乱，继而导致肿瘤的不断发展[27-29]。细胞受到凋亡因素刺激后，线粒体的功能和结构都会发生异常，线粒体呼吸链氧化磷酸化脱偶，细胞内ROS生成增多，活性氧生成达到一定程度后可使线粒体肿胀，导致线粒体膜的通透性改变；ROS可促发和加速线粒体膜通透性转运孔的异常开放，导致ROS生成进一步增多，形成正反馈，使线粒体膜电位下降加速至不可逆，发生细胞凋亡[30]。

本文对白藜芦醇作用于H446细胞后，细胞凋亡、活性氧及线粒体膜电位3个指标进行了观察，这些观察指标与线粒体功能密切相关，并从不同浓度、不同时间来进行观察。实验结果表明，白藜芦醇可诱导H446细胞凋亡，增加细胞内活性氧的生成，导致线粒体膜电位下降，且其作用具有时间依赖和浓度依赖的特点，差异有统计学意义，P<0.01。

细胞凋亡可导致线粒体功能障碍，可引起ROS生成增多，而ROS生成增多可使线粒体肿胀，线粒体肿胀后通透性增高，使得线粒体膜电位的电压平衡不能维持，导致线粒体膜电位下降，线粒体结构破坏，功能发生异常，线粒体功能发生异常后，又可诱导细胞凋亡，因此，以上因素相互作用、相互影响，形成因果循环。本文结果显示白藜芦醇对H446细胞的抑制与线粒体功能障碍密切相关。这一途径在Luo 等[31]研究中亦得到证实，该研究结果认为白藜芦醇可通过ROS介导的DNA损伤诱导肺癌细胞早衰。另一项关于白藜芦醇诱导人肺腺癌细胞A549的研究结论，亦认为白藜芦醇的促细胞凋亡功能与线粒体功能障碍相关[32]。

综述所述，白藜芦醇对H446细胞增殖具有明显的抑制作用，可诱导H446细胞凋亡，细胞内ROS释放增多，并进一步导致线粒体膜电位下降，其作用效果具有浓度依赖和时间依赖的特点。白藜芦醇可通过线粒体功能障碍途径诱导H446细胞凋亡。