一株罕见Ihumii放线菌的分离和鉴定

张维清，林宇岚，甘龙杰，陈守涛，张文明，杨 滨△

(福建医科大学附属第一医院：1.检验科；2.骨科，福建福州 350005)

放线菌大多存在于健康人口腔、上呼吸道、胃肠道和泌尿生殖道等与外界相通的腔道，是寄居人体的一种正常菌群[1-2]。当机体免疫力减弱、口腔卫生不良、拔牙或外伤时，可侵入组织导致皮肤、皮下组织，肌肉，骨骼及中枢神经系统化脓性感染[3]。根据感染的途径和涉及的器官不同，临床上分为面颈部、胸部、腹部和中枢神经系统感染。其主要特征为慢性化脓性肉芽肿病变，以向周围组织扩展形成瘘管并排出带有硫磺样颗粒的脓液为特征。绝大多数放线菌易引起内源性感染，大量应用免疫抑制剂是一个重要的诱发因素。2015年，法国科学家从一个50岁的HIV感染者粪便中首次分离出一株新的放线菌，并命名为Ihumii放线菌[4]。福建医科大学附属第一医院于2016年收治一例由Ihumii放线菌引起的膝关节化脓性感染，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 患者，男，72岁，既往患有高血压和甲状腺功能亢进。就诊本院前2月因外伤致“左膝髌骨粉碎性骨折”，于院外行“左髌骨骨折切口复位内固定术”，术后切口愈合不良。术后1个月，因“左膝切口裂开”再次求诊，该院行“左膝部二期清创术”，术后10 d切口流出黄脓液、发恶臭、伴发热。遂于当地医院多次行清创术，治疗上予抗感染、补液及对症治疗(具体不详)，今为求进一步诊治，患者就诊福建医科大学附属第一医院骨科，门诊拟“左膝关节感染”收入住院(图1A)。实验室检查,白细胞计数(WBC):17.9×109/L,血红蛋白(Hb):112 g/L,血小板计数(PLT):230×109/L,C反应蛋白(CRP):59.5 mg/L,PCT:0.38 ng/mL。

1.2仪器与试剂 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)、甲酸、α-氰基-4-羟基苯丙酸(HCCA)均由德国Bruker公司及Sigma公司提供；ABI 2700普通PCR仪(美国应用生物系统)；快速革兰染色液(Baso)；细菌16S rRNA 基因扩增通用引物：27f:AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 和1492r：TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT由上海生工合成，PCR反应体系采用美国Promega公司产品。

1.3细菌培养及形态观察 脓液分泌物标本分区划线接种于2块哥伦比亚血平板、一块沙保罗葡萄糖琼脂培养基、一块选择巧克力平板。一块血平板与选择巧克力平板置于5%二氧化碳培养箱中，35 ℃恒温孵育，每天观察血平板的生长情况；另一块血平板行厌氧培养，35 ℃恒温孵育，每天观察平板的生长情况。沙保罗葡萄糖琼脂培养置于25 ℃恒温孵育，亦每天观察其生长状况。术后坏死组织经研磨后，亦行上述同条件培养。根据第四版《全国临床检验操作规程》，阳性培养进行革兰染色，油镜观察菌体形态。

1.4细菌MALDI-TOF-MS鉴定 用牙签挑取单个待检菌落，均匀涂抹于加样金属靶板小圈内，同时在另一小圈内亦均匀涂抹ATCC25922大肠埃希菌质控菌株，待样本室温干燥后，加入1 uL的甲酸(70%)，室温干燥后，加入1 μL的HCCA，待室温干燥后上机检测。

1.516S rRNA基因扩增及系统发育树的构建 采用煮沸法提取细菌的基因组核酸。细菌16S rRNA的PCR扩增条件参考文献[5]。扩增产物经电泳，确认存在目的条带，产物送上海生工测序。测序的序列用Vector NTI 8.0软件包中的Contig Express组件拼接。获得的16S rRNA序列在GeneBank中进行Blast同源性比对初步确定其分类位置。用Bioedit(vision3.3)合并样本序列(序列名2016R)和参考序列为一个队列，用MEGA5.1软件以Kimura双参数方法构建16S rRNA系统进化树。

2 结 果

2.1病原菌培养结果 脓液和术后坏死组织经分离培养后，均得到一株革兰阳性短杆菌。其生长速度较缓慢，初次培养48 h后可形成直径大约1～2 mm、灰白色、圆形、光滑、突起、边缘整齐、无β溶血性菌落(见图1B)，与文献报道的一致[4]。在沙保罗葡萄糖琼脂培养基和选择巧克力平板均不能生长。

注：A为患者入院时左膝关节创伤伴化脓性感染；B为5%CO2培养箱35 ℃培养48 h后血平板菌落形态

2.2细菌MALDI-TOF-MS鉴定结果 目标菌通过MALDI-TOF-MS检测及BioType软件分析，获得的目标菌肽指纹图谱如图2示。鉴定结果报告显示为瑞丁放线菌，但可信度为1.902。根据MALDI-TOF-MS报告对结果的解读[6]，当可信度值为1.700～1.999时，可鉴定放线菌属，不能确定为放线菌某种，需进一步鉴定。

图2 Ihumii放线菌MALDI-TOF-MS鉴定结果图

图3 2016R放线菌部分16S rRNA基因与Ihumii放线菌及其他放线菌系统进化树

2.316S rRNA基因序列鉴定及进化树分析 扩增得到16S rRNA基因的反向序列，大小约870 bp，正向多次测序均失败，存在较多杂峰、背景信号干扰，所以未纳入本次分析中。反向的一半16S rRNA序列经编辑，提交NCBI的Blast显示，其与Ihumii放线菌(核酸登录号为LN866997和NR144728.2)相似率为100%。为了能够更直观反映该菌来源，本课题组利用MEGA5.1软件Neighbor-joining tree法，构建16S rRNA进化树。如图3所示，可以明显看出，本次发现的2016R放线菌株与2株2015年由法国科学家发现的Ihumii放线菌明显在一簇上，Bootstrap值为72%。而且，他们共同与其他参考放线菌成一簇，Bootstrap值为99%。

3 讨 论

放线菌病是一种少见的因感染放线菌所致的慢性感染性疾病，人兽共患，可产生局部化脓或肉芽肿性疾病，以多发脓肿和窦道瘘管为特征。根据现有的文献报道，放线菌病存在明显的区域和性别差异，农村明显高于城市，男性多于女性，城市发病率仅为农村的1/10，男女比例约为3∶1[7]。目前放线菌属内有47个种，由于其生在缓慢、培养条件苛刻，在行常规细菌培养时，容易被遗漏[8]。同时，又由于国内对放线菌感染临床特点、诊断、鉴别诊断等研究仍较少，而且，该菌属所致疾病常呈隐匿性，缺乏较为典型的临床表现，容易造成临床医生的诊断与治疗困难，产生误诊或漏诊。MALDI-TOF-MS是最近发展起来的一种可以快速鉴定细菌的新技术，依据不同菌种形成特异性的质谱指纹图谱对细菌进行鉴定，该技术可以快速、准确鉴定临床常见菌[9]，但对少见、罕见菌鉴定时，由于其菌谱库中种类数量有限，其在鉴定方面仍存在着缺陷[6]。据LYNCH等[10]报道，MALDI-TOF-MS在鉴定放线菌方面，仅41%的放线菌能准确鉴定到种，9%鉴定到属，存在50%无法准确鉴定。本文开始采用MALDI-TOF-MS进行鉴定，并以鉴定为瑞丁放线菌种，但鉴定值为1.902，所以可以确定2016R为放线菌属某种，但无法确定其准确种。

利用16S rRNA序列同源性分析对细菌进行分类鉴定的技术已经比较成熟。随着GeneBank数据库的不断完善，应用该技术可以对病原菌进行快速、准确简便的分类鉴定。目前，应用16S rRNA鉴定细菌菌属时，当目标菌与GeneBank中比对序列相似度大于99%，可以鉴定为种；相似度为97%～99%，鉴定为属；相似度低于97%，无法鉴定，可能为某种新的细菌[11]。因此，本研究又采用16S rRNA测序技术对菌株进一步复核鉴定，最终与Ihumii放线菌相似度为100%；同时如图3所示，2016R菌株与Ihumii放线菌成一簇，由此可以鉴定本研究新发现的菌株为Ihumii放线菌。本研究相对不足之处是未得到16S rRNA约1 500 bp长度的序列，尽管如此，但根据以往的文献报道，序列在300～900 bp之间就可以适用于多数广谱PCR的诊断[12]。所以本研究中870 bp长度的序列在通过GeneBank中比对和进化树分析后是可以确定该菌就是Ihumii放线菌的。

对于膝关节创伤放线菌感染，由于病例较少，目前尚无统一的治疗方案。根据相关文献报道[13]，目前多首选β-内酰胺类抗菌药物进行治疗，在临床治疗过程中也根据药敏结果使用一种或多种抗菌药物联合治疗，疗程约为6到12个月，早期诊断及有效抗菌药治疗的治愈率可达90%[14]。但也有专家指出，在治疗中应按照患者具体病情情况、感染部位的不同，选择手术或非手术治疗[15]。本病例中患者创伤明显、组织坏死、脓液外流，通过手术，不但可以清除坏死组织加速伤口愈合，而且能够获取深部脓液、坏死病灶等送微生物室培养和病理检查。该患者最终经过清创、皮瓣移植、抗菌药物应用，3个月及半年后回访复查，患者得以痊愈。

放线菌病在目前的临床病例中并不常见，其诊断除了需要影像学、病理学分析外，更重要的是临床医生能否正确采集脓液、组织标本，及时送检，为微生物实验室提供合格标本。临床微生物工作者也需要加强对放线菌病的认识，有条件是实验室可适当开展更可靠的现代诊断方法，如基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱、分子生物学分类方法，以便能快速诊断放线菌病并指导临床医生合理用药。同时，本病例提示，在处理感染性疾病时，除了常见细菌、真菌、病毒感染外，要警惕少见菌、罕见菌的感染，以免误诊耽误治疗，危及患者生命安全。