钛纳米管表面固定GL13K抗菌肽的实验研究

王泽华，程佳蕙，高啟坤，宋婷婷，吴明月

钛金属因其良好的生物相容性，成为牙种植体的基本材料，然而其本身不具有抗菌性，因此如何提高钛种植体表面的抗菌性能一直是该领域研究的重要内容[1]。近年来，在含纳米结构的钛种植体表面固定抗菌肽(antibacterial peptide,AMP)，构建生物活性抗菌涂层成为该领域研究的热点[2]。二氧化钛(titanium dioxide ,TiO2)纳米管具备化学性质稳定、耐腐蚀、结构规整、高度有序，一端开口而另一端封闭的特性，其特有的蜂窝管状结构、较大的比表面积可作为特定生物大分子及抗菌药物的有效载体，且能够对目的成分具备缓释效应[3]。该实验通过阳极氧化法在钛基材表面原位构建TiO2纳米管结构，再通过物理吸附、共价结合及层层自组装将GL13K抗菌肽固定至纳米管材料表面，构建生物活性抗菌涂层，比较其固定效果，为种植体表面的抗菌改性及种植体周围炎的治疗研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1材料及试剂纯度99.99%钛箔片购自北京中金研新材料科技有限公司；异硫氰酸(fluorescein isothiocyanate,FITC)荧光标记的GL13K抗菌肽购自上海科肽生物科技有限公司；多巴胺、海藻酸钠购自北京天根生化科技有限公司；丙酮、乙二醇、氟化铵、氯化钙购自广州西陇化工有限公司；试剂均为分析纯。

1.2实验仪器LP6003D型直流稳压电源购自深圳乐达精密工具有限公司；Sirion-200场发射扫描电镜(FESEM)购自美国FEI公司；X射线光电子能谱仪(XPS)、傅里叶红外光谱(FTIR)购自美国Thermo-VG Scientific公司；接触角测量仪购自成德成慧试验机器有限公司；正置荧光显微镜购自日本Nikon公司；UV-1800紫外-可见分光光度计购自日本岛津公司。

1.3实验方法

1.3.1钛纳米管的制备 将钛箔片加工成直径为15 mm的圆形光滑钛片，依次放入丙酮、75%无水乙醇、去离子水中，超声清洗各20 min。再放入90 mmol/L氟化铵电解液中，石墨接负极，钛片接正极，两步法阳极氧化：15 V、10 min；50 V、60 min。最后将样品置于去离子水中超声清洗3～5 min，干燥备用。

1.3.2实验分组 分为4组：钛纳米管组(A组：空白对照组)，物理吸附组(B组)，共价结合组(C组)和层层自组装组(D组) 。

1.3.2.1钛纳米管组 上述阳极氧化法制备的钛纳米管，未吸附GL13K抗菌肽。

1.3.2.2物理吸附组 将钛纳米管浸入经FITC荧光标记的、0.2 mg/ml的GL13K抗菌肽溶液中12 h，避光，真空干燥备用。

1.3.2.3共价结合组 将钛纳米管浸入2 mg/ml的多巴胺溶液中12 h，避光，再置于去离子水中清洗，干燥备用；再将上述处理的纳米管完全浸入至经FITC标记的、0.2 mg/ml的GL13K肽溶液中12 h，避光，真空干燥备用。

1.3.2.4层层自组装组 将钛纳米管浸入至2 mg/ml的海藻酸钠溶液中10 min，再置于去离子水中清洗，真空干燥；而后在样品表面滴加0.2 mg/ml的GL13K肽溶液，使液滴覆盖整个基材表面，再次干燥，依次循环，直至抗菌肽溶液滴加完毕；最后将上述处理完成的纳米管浸入2% CaCl2溶液中10 min，真空干燥备用。

1.3.3样品的表征 分别使用FESEM、接触角测量仪、XPS、FTIR及荧光显微镜对上述4组样品进行表征；紫外分光光度计检测样品表面抗菌肽的释放曲线(将含有抗菌肽的样品置于12孔板中，并加入1 ml磷酸盐缓冲液(PBS)，放入温度为37 ℃的恒温摇床中，再分别于1、2、4、8、12、24 h；2、3、5 d取出200 μl释放液以检测其中抗菌肽的浓度，并重新加入200 μl新的PBS溶液。

2 结果

2.1钛基材表面形貌表征FESEM显示：光滑钛片为镜面状；钛纳米管为特有的蜂窝状结构，管腔直径均匀一致，多为80 nm左右；断面显示钛纳米管的高度约2.4 mm。见图1。

图1 光滑钛片及TiO2纳米管的表面微观结构

A：光滑钛片×100 000；B：TiO2钛纳米管×100 000；C、D：钛纳米管断面×30 000

2.2材料表面亲水性分析实验组的接触角相对于空白对照组均有不同程度增加，亲水性减弱。这与材料表面接枝了弱亲水性的GL13K以及多巴胺、海藻酸钠封闭了纳米管管口相关。差异有统计学意义(F=90.438，P<0.05)，LSD-t检验对组间两两比较，结果显示4组各组之间差异有统计学意义(P<0.001)。见表1、图2。

表1 各样品表面接触角角度

2.3XPS分析结果显示400 eV处，实验组氮元素的波峰较对照组均明显上升。表明GL13K成功固定在钛基材表面。见表2、图3(共价结合组的检测中增加了多巴胺修饰组，以排除多巴胺溶液中氮元素的干扰，即图3中的D组)。

图2 接触角测量图片

表2 钛纳米管样品不同方法固定多肽后表面各元素含量(%)

2.4FTIR检测结果显示吸收波为1 630 cm-1时实验组的波峰均与GL13K抗菌肽的波峰一致，此为氨基化合物的波峰，表明GL13K成功固定在钛基材表面。见图4。

2.5免疫荧光分析空白对照组材料表面无荧光分布；实验组材料表面均可见不等量的荧光，其中共价结合组的荧光分布量较多且均匀，证实GL13K已成功固定在钛基材表面。见图5。

2.6GL13K抗菌肽的释放曲线由释放曲线可见：物理吸附组样品表面的GL13K释放速度最快，释放时间短，24 h GL13K基本完全释放；共价结合组样品表面的GL13K 24 h内突释明显，之后释放速度减缓；层层自组装组样品表面的GL13K 24 h内突释较为明显，而后释放速度有所减慢，整个释放过程较其它两组更为稳定，至第5天时GL13K仍持续释放。见图6。

3 讨论

目前，通过物理、化学方法在钛种植体表面构建各种抗菌涂层，成为钛种植体表面抗菌改性研究的主流[1]。根据是否向周围释放抗菌物质，可将抗菌涂层分为直接抗菌涂层和抗菌物质释放的抗菌涂层，前者如季铵盐类及抗菌肽类涂层，后者是由抗菌剂与载体材料相结合的复合涂层[1]，其中，AMP广泛存在于生物体内，是由生物细胞特定基因编码的一类带正电荷的两亲性小分子多肽，表现出抗菌谱广、理化性质稳定、不易产生耐药等特点而备受关注[4-5]。因此，本实验选择来自于人类腮腺蛋白的GL13K抗菌肽为研究对象，通过3种不同涂层构建方法的比较来考察其结合效果。作为一种新型肽，GL13K肽不易被酶解且细胞毒性极低，与成骨细胞有良好的生物相容性[6]，实验[7]证明其能够以5～10 μg/ml的最小抑菌浓度抵抗种植体周围炎优势菌即牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌。因此，本研究采用TiO2纳米管为基材，将GL13K抗菌肽接枝至纳米管表面，以期提高钛种植体表面的抗菌性能。

图3XPS分析图谱

A：钛纳米管组；B：物理吸附组；C：共价结合组；D：多巴胺修饰组；E：层层自组装组

图4 FTIR检测结果

图5 荧光分析结果 ×200

近年来，纳米化修饰是钛种植体表面改性研究的重要内容，钛基材表面的纳米级形貌可抑制细菌的黏附和生物膜的形成[8]，且纳米结构的钛基材表面可实现对目的分子的缓释效应。缓释体系的构建可使AMP等生物活性成分在基材表面得到可控有序的释放，从而达到持续抗菌效果[9]。研究表明，TiO2纳米管化学性质稳定、结构规整，与钛基体结合牢固，可作为多肽、生长因子等生物活性分子的缓释载体[3]，且80 nm管径的纳米管能够实现最大的载药量[10]。据此，本实验采用阳极氧化法在钛基材表面原位构建高度有序的TiO2纳米管阵列，SEM观察呈特有的蜂窝管状结构，其管腔直径多为80 nm左右，断面结果显示其高度约2.4 mm。本实验的AMP释放曲线证实TiO2纳米管本身具有“缓释”性能，但其缓释效果不佳，其表面吸附的GL13K 24 h内基本完全释放，因此，在纳米管表面构建各种“涂层”结构以封闭管口，增加其缓释效应成为目前的研究热点，常见的涂层成分有海藻酸盐、钙磷、壳聚糖、胶原凝胶等[11]。

图6 抗菌肽释放曲线

如何将AMP类的生物有机大分子接枝到具有生物惰性的钛基材表面，一直是该领域研究的难题。目前钛基材表面接枝生物活性多肽的方法主要有物理吸附、共价偶联、层层自组装等方法。本实验对上述3种固定方式进行比较分析，FTIR的检测结果表明实验组样品表面均成功接枝GL13K抗菌肽；显微荧光及XPS检测结果亦进一步证实实验组样品表面均成功固定AMP成分，且共价组的载负量最多。本实验中，共价结合法所使用的交联剂为高度亲水性的多巴胺，其能够在固体材料表面形成附着牢固的聚多巴胺薄膜层，而后氧化成醌式结构，与有机分子的功能基团发生共轭加成反应，实现有机分子的固定，课题组前期研究[12]已证实经多巴胺溶液处理的钛纳米管可实现与多肽的结合。由AMP的释放曲线可见自组装组的样品表面至第5天时仍有GL13K持续释放，表明该组的缓释效应优于其它两组。层层自组装法使用了亲水性强的海藻酸钠，其化学性能稳定、生物相容性良好，中性条件时，羧基解离带负电荷，与带正电荷的GL13K肽通过静电作用吸附在钛纳米管表面；在Ca2+水溶液中，海藻酸钠可迅速与Ca2+发生交联反应，交联后形成溶解性低的藻酸钙凝胶，可增加其缓释效应[13]。

本实验通过阳极氧化的方法将纯钛片制备成TiO2纳米管结构，并使用3种方法将GL13K抗菌肽接枝至钛纳米管表面，成功构建生物活性抗菌涂层，其中，层层自组装法的缓释效应最佳，有望能够提高钛种植体表面的持续抗菌性能，为种植体表面的抗菌改性及种植体周围炎的治疗研究提供了新的思路和方法。该研究构建的抗菌涂层的生物学效应尚有待体外细胞学及体内动物实验的进一步验证。本研究GL13K抗菌肽是经FITC荧光标记的成品，免疫荧光分析时荧光衰减较快，导致荧光检测显示偏弱。