PLGA微米与纳米载药颗粒用于药物携带与递送的比较研究

林彦霞，白 睿，刘志强，刘惠亮

聚乳酸-羟基乙酸共聚物(polylactic acid-glycolic acid copolymer，PLGA)具有良好的生物可降解和生物相容性，是由美国食品和药物管理局批准的可安全使用的药用高分子材料，其降解作用可实现缓释药物的目的[1，2]。PLGA多聚物分子表面可以与多种生物分子通过共价或物理吸附有效结合，可以通过结合适配体、多肽及核酸等建立靶向系统，既能增大靶部位的药物浓度又可以在体内递送中减少创伤[3-5]。因PLGA系统具有控制颗粒大小、控制药物释放、延长药物释放时间、靶向释放、降低药物毒性和刺激性、保护药物活性、提高治疗效果[6]等特点已被广泛应用于包载药物[7-11]。微米和纳米两种粒径颗粒都是常用的药物载体，但面对不同组织损伤类型，如何选择不同颗粒类型，仍然缺乏直接的研究依据，以致不同研究报道中用法多样[12]。本研究在表面特征、载药能力、药物缓释能力，以及细胞吞噬能力等方面对两种PLGA颗粒进行了评价，以期为如何选择合适的PLGA颗粒提供一种策略。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

1.1.1 实验仪器 琼脂糖凝胶电泳仪(DYY-10C型)，ChampGel摄像仪(北京赛智创业科技有限公司)，紫外分析仪(北京宾达英创科技有限公司)，紫外可见分光光度计(UV2800，上海)，CO2细胞培养箱(3111REL#5，US),超声波细胞粉碎机(SCIENTZ-IID,中国)，激光粒度及电位分析仪(NANO ZS-90,英国 Malvern)。

1.1.2 实验材料 PLGA(PLGA-50:50，由山东省药学科学院、山东省医疗器械研究所提供)，二氯甲烷(DCM)，聚乙烯醇(PVA, sigma)，聚乙烯亚胺(PEI)，褪黑素(melatonin)，香豆素，核酸(质粒由本实验室合成)。

1.2 方法

1.2.1 采用超声乳化方法制备PLGA纳米颗粒 载褪黑素的纳米颗粒[13-15]即蒸馏水5 ml,5%PVA5 ml，二者作为外水相，油相即0.03 g褪黑素和0.10 g PLGA固体颗粒加入2 ml DCM形成乳液，超声5～10min，制备纳米颗粒。

1.2.2 采用机械搅拌乳化方法制备PLGA微米颗粒 载褪黑素微米颗粒[16-18]，方法同纳米粒制备的水相和油相，溶液放于振荡器上震荡5～10 min，制备微米颗粒。

1.2.3 表面特征检测 两种颗粒采用透射电镜、扫描电镜和动态光散射检测，评价其各自的表面特征，粒径均一性。

1.2.4 两种颗粒的载药量，药物缓释 两种载药颗粒最后分别用2 ml水重悬沉淀，各取两管100 μl重悬溶液，于紫外可见分光光度计下测其吸光度，同时另100 μl制备好的载药纳米颗粒与微米颗粒，测其质量，计算载药量。两种颗粒分别各取两管，每管300 μl，均用500 μl PBS溶液重悬沉淀，放于37 ℃孵箱，分别收集上清于新的EP管中，最后用紫外可见分光光度计测其278 nm处的褪黑素吸光度。再根据标准曲线计算出相应的浓度，最后计算两种颗粒的药物累积释放率，并绘制图表。

1.2.5 细胞吞噬 体外培养人胚肾293T细胞株，细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，37 ℃，5% CO2的培养箱中培养。按照5×104/孔将293T细胞接种在6孔板中，分四组，每组设两个副孔，四组细胞分别于6、12、24、48 h四个时间点在荧光显微镜下观察细胞吞噬情况。PLGA固体颗粒与荧光材料香豆素共溶于二氯甲烷，平分两份分别制备微米和纳米颗粒。最后制备成等量的溶液，各加6 μl氨苄西林钠，放于4 ℃，过夜。每孔细胞各加10 μl样品。

1.2.6 荧光强度测定 利用软件IPP6.0分析测定细胞吞噬的荧光强度。

2 结 果

2.1 空载PLGA颗粒的表面特征 微米颗粒表面很光滑，典型的球形结构，粒径不均一，大致范围为3～5 μm，结果如图1A。纳米颗粒粒径相对均一，范围为200～300 nm，如图1B所示。纳米颗粒采用马尔文ZS90粒度分析仪来检测颗粒的水合粒径，结果与扫描电镜检测结果相似见图1C。微米颗粒结果如图1D，粒径大部分分布在2～5 μm的范围内。

图1 两种空载PLGA颗粒的表面特征检测结果

A.微米米颗粒的扫描电镜检测结果；B.纳米颗粒的扫描电镜检测结果；C.纳米颗粒的粒径分布范围；D.微米颗粒的粒径分布范围

2.2 药物缓释比较 纳米颗粒存在显著的早期突释现象，大部分药物在12 h内释放，后续仍可缓慢持续释放2～4 d，见图2A；微米颗粒释放时间较长，持续缓释可达一周左右，见图2B。

图2 两种颗粒的药物缓释图

2.3 细胞吞噬情况 纳米颗粒与细胞共孵育12 h即达到最大值，如图3-NP，微米颗粒24 h即达到最大值，如图3-MP。检测荧光强度可见纳米颗粒12 h即达到最大值，见图3A；微米颗粒相对较慢，最大值出现在共孵育24 h后，见图3B。

图3 两种颗粒的细胞吞噬

A.纳米颗粒的细胞吞噬荧光强度，*代表12 h时荧光强度达到高峰；B.微米颗粒的细胞吞噬荧光强度，*代表24 h荧光强度达到高峰

3 讨 论

多种具备生物可降解性、安全性的高分子聚合物已经被广泛地作为药物载体使用。其中PLGA 具有良好的生物相容性和可降解性，并且是被 FDA 批准的药用高分子材料。因此，其作为载体包裹药物形成颗粒是载药系统研究领域的热点。

在本研究中，我们制备了两种粒径范围的颗粒，并且在二者的各种应用性能方面进行了比较[1,8,11,12]，评价PLGA纳米颗粒与微米颗粒的表面特征、载药能力、药物缓释能力及细胞吞噬能力等方面。结果显示纳米颗粒的粒径均一性较好，可能是因为纳米颗粒采用超声技术相比微米颗粒的机械搅拌方法制得的颗粒均匀性更好，且两种颗粒呈现出明显的球形结构且形态规整。两种颗粒携带褪黑素的能力相当，在药物缓释方面，纳米颗粒存在显著的早期突释现象，大部分药物在12 h内释放；微米颗粒释放时间较长，持续缓释可达一周左右，可见PLGA纳米颗粒作为化学药物载体更适合于急性组织或细胞保护，微米颗粒更适合于慢性持续性保护；在携带药物进入细胞能力方面，分别在四个时间点观察细胞对颗粒的吞噬情况，粒径相对小的PLGA纳米粒更容易进入或与细胞结合，微米颗粒相对较慢。

本研究通过对PLGA两种颗粒各方面进行评价，得出了二者的不同应用范畴。结果证明微米颗粒控释系统适用于半衰期短、口服生物利用度低、需要长期使用的药物，其优点在于几周甚至几个月时间内仍能释放药物，维持有效血液浓度，减少药物的给药次数，增强治疗效果。缓释的不同是因为药物是内包于颗粒中，缓释与颗粒的比表面积成正比[19]，与微米颗粒相比，纳米颗粒粒径小，比表面积大，故而释放的快；对于细胞吞噬，纳米颗粒由于粒径小易被细胞吞噬，在12 h便达到吞噬高峰，而微米颗粒则24 h达到吞噬高峰，吞噬高峰之后由于进入细胞内的颗粒降解药物释放，故荧光强度降低。对于两种颗粒的应用，当前很多研究报道了基于PLGA颗粒的多种修饰方法可以使颗粒系统达到药物缓慢释放的目的[10,20,21]，但最终能否满足实验要求，仍需进一步探索。

本研究结果表明，PLGA纳米颗粒作为药物控释载体更适合于急性组织或细胞保护，微米颗粒更适合于慢性持续性保护，对于我们之后如何选择不同粒径的PLGA颗粒提供了参考价值，期望能够更高效发挥两种颗粒的应用价值。