siRNA靶向抑制SPAG9对HepG2细胞增殖、凋亡及JNK信号通路的影响

罗书笛 任碧琼 刘俊龙 陈 维

肝癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一，发生率位居世界第5位，病死率位居第3位。据2015癌症研究报告报道，全世界每年有748300例新增肝癌，中国占50%[1]。由于肝癌起病隐匿，发展迅速，多数患者确诊时已处于中晚期，此时瘤体体积较大，并伴随微血管侵犯及远处转移，预后极差[2]。因此，有必要探索肿瘤相关分子在肝癌发生、发展关键环节中的作用，寻找靶向治疗靶点，为临床肝癌的早期诊断与治疗提供新的手段。

精子相关抗原9(sperm associated antigen 9，SPAG9) 属于癌睾丸抗原家族，定位于人类染色体17q21.33的单拷贝基因。人类SPAG9由4个结构域组成：一个亮氨酸拉链结构，两个卷曲螺旋，一个跨膜结构域以及JNK结合结构域(JNK binding domain，JBD)。SPAG9正常在睾丸组织中表达，定位表达于精子顶体的赤道板区域，在受精过程中发挥重要作用；当异位表达于肿瘤组织中时，会诱发较强的体液免疫应答，产生特异性抗体，有望作为肿瘤早期诊断的血清标志物[3,4]。研究表明，SPAG9在乳腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌、宫颈癌、前列腺癌、胃癌等多种肿瘤中存在过表达，且与肿瘤的发生、发展及其预后有关[5～10]。

目前，SPAG9在肝癌中的表达及其调控肝癌生物学行为的研究尚不多见。笔者的前期研究发现，与L02正常肝细胞株比较，SPAG9在QGY7703、HepG2、Bel-7402、Hep3B等多种肝癌细胞株中均高表达，并研究了SPAG9对QGY7703细胞增殖、迁移及凋亡的影响。为了进一步验证SPAG9对肝癌细胞的影响，本研究探究SPAG9在肝癌HepG2细胞中的表达模式，并观察采用siRNA敲低SPAG9后对肝癌发生、发展的影响。

材料与方法

1.材料：人肝癌细胞HepG2购自中南大学湘雅医学院细胞库。细胞培养液RPMI-1640、胰蛋白酶购自美国Gibco公司，青/链霉素、PBS购自美国Hyclone公司。Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司。靶向人源性SPAG9小干扰RNA(SPAG9siRNA)和control siRNA由上海吉凯基因化学技术有限公司合成。抗SPAG9单克隆抗体(ab12331)、抗JNK单克隆抗体(ab179461)、驴抗兔荧光二抗(ab150073)购自英国Abcam公司,抗GAPDH抗体(LC A04)购自艾佳生物(Auragene)公司。CCK8试剂盒购自日本Dojndo公司。

2.方法：(1)细胞培养：人肝癌细胞HepG2在含10%胎牛血清、1% 双抗的RPMI-1640的完全培养基中，于37℃ 5% CO2条件下培养。每2～3天用0.25%的胰蛋白酶消化，以1∶2传代培养。(2)细胞双色免疫荧光实验：将生长状态良好的肝癌细胞HepG2接种于细胞爬片上，37℃ 5% CO2培养箱中培养24h。将制作好的HepG2细胞爬片置于4%多聚甲醛中固定20min，Triton-X100通透3min，5% BSA封闭1h，抗SPAG9抗体(1∶50)4℃孵育过夜。次日，PBS清洗3遍，驴抗兔-FITC荧光二抗(绿色)37℃孵育1h，PBS清洗3遍，DAPI染液(蓝色)染细胞核10min，PBS清洗3遍，激光共聚焦显微镜下观察拍照。(3)siRNA转染：siRNA转染实验分组:对照siRNA组和SPAG9siRNA组。siRNA转染：取对数生长期的HepG2细胞接种于6孔板上，密度为5×104个细胞/孔，培养至细胞50%～60%融合时进行转染。PBS清洗细胞3遍后，每孔加入1.5ml无血清无双抗培养基，采用Lipofectamine 2000每孔转染2μg质粒。(4)CCK8细胞增殖活性检测：取对数生长期的HepG2细胞接种于96孔板上，密度为1×104个细胞/孔，实验组转染SPAG9siRNA，同时设置空白组和对照组，37℃ 5% CO2培养箱中培养24h、48h后，弃去96孔板中的旧培养基，PBS清洗后加入新鲜培养基，同时每孔加入10μl CCK8溶液，混匀，37℃避光孵育2h后，酶标仪450nm波长处检测吸光度值(A值)。(5)流式细胞凋亡检测：胰酶消化收集肿瘤细胞，PBS洗涤细胞2次，每次2000r/min离心5min，收集约(1～5)×105细胞；加入500μl的Binding buffer 悬浮细胞，加入5μl Annexin V-FITC混匀后，加入5μl Propidium Iodide，混匀；室温、避光，反应5～15min，1h内，在流式细胞仪观察检测。(6)流式细胞周期检测：消化收集细胞沉淀，800r/min，离心5min，弃上清；加入1ml 预冷的PBS重悬细胞，800r/min离心5min，离心收集细胞；重复1～2次，去除乙醇；加入150μl PI(碘化丙啶)工作液，4℃ 避光染色30min；转至流式检测管，上机检测，PI用488nm氩离子激光器激发，由630nm通滤光片接收，通过FSC/SSC 散点图收集10000个细胞，采用设门技术，排除粘连细胞和碎片，分析PI荧光直方图上各细胞周期的百分率。(7)Western blot法实验检测：肝癌细胞HepG2转染SPAG9siRNA 24h后收集细胞,加入细胞裂解液，冰上裂解20min，4℃ 10000r/min离心10min,取上清液，BCA法检测蛋白浓度。加入5×SDS上样缓冲液，煮沸5min，-20℃保存。配置8% SDS-PAGE胶，蛋白上样量为30μg常规电泳、转膜。5%脱脂奶粉室温封闭2h，4℃孵育SPAG9(1∶1000)、GAPDH(1∶3000)一抗过夜；二抗(1∶4000)孵育1h。PBST(含0.1% Tween-20的PBS溶液)洗膜3次,每次15min。ECL发光液与膜孵育3min后，暗室显影曝光。

结 果

1.SPAG9在肝癌HepG2细胞中的表达：细胞免疫荧光实验结果显示，阴性对照细胞平均吸光度值为0，实验组肝癌细胞荧光平均吸光度(A)值为0.602±0.031，差异有统计学意义(t=4.334,P=0.012)，定位于细胞质及细胞核中(图1)。

图1 细胞双色免疫荧光检测SPAG9在肝癌细胞HepG2中的表达及定位(×200)绿色荧光为FITC标记的SPAG9蛋白，蓝色荧光为DAPI标记的细胞核

2.SPAG9siRNA对HepG2细胞SPAG9及JNK蛋白表达水平的影响：Western blot法分别检测SPAG9siRNA组(HepG2i)和对照组(HepG2)SPAG9蛋白的表达，结果显示SPAG9siRNA组SPAG9蛋白表达水平显著低于对照组(P=0.001)，SPAG9siRNA组JNK蛋白表达水平显著低于对照组(P=0.302，图2)。

图2 Western blot法检测HepG2细胞SPAG9及JNK的表达A.转染SPAG9 siRNA前后SPAG9的表达；B.转染SPAG9 siRNA前后JNK的表达；C.SPAG9和JNK蛋白灰度分析柱状图。*P<0.05，**P<0.01，n=3

3.SPAG9siRNA对HepG2细胞增殖能力的影响：CCK8实验结果显示，与对照组比较，转染SPAG9siRNA 24h及48h后HepG2细胞的增殖能力均明显降低，差异有统计学意义(P均为0.000，表1，图3)。

表1 CCK8增殖结果分析

*P<0.01

图3 SPAG9 siRNA对肝癌细胞HepG2增殖能力的影响*P<0.01(n=3)

4.SPAG9siRNA干扰对肝癌HepG2细胞周期的影响：流式细胞术检测转染前后HepG2细胞周期的变化，结果显示，与对照组比较，SPAG9siRNA组的细胞周期G1期细胞显著减少(t=28.578，P=0.000)，S期细胞显著增多(t=-26.658，P=0.004)，细胞周期阻滞于S期(表2，图4)。

表2 流式细胞术细胞周期检测 (%)

*P<0.05,**P<0.01

图4 SPAG9 siRNA对肝癌细胞周期的影响A.转染SPAG9 siRNA前后流式细胞周期检测图；B.转染前后HepG2细胞周期分析柱状图；*P<0.01，n=3

5.SPAG9siRNA干扰对肝癌HepG2细胞凋亡的影响：采用流式细胞术检测转染SPAG9siRNA前后HepG2细胞凋亡率的变化，结果表明，与对照组比较，SPAG9siRNA组细胞凋亡率显著增加(t=-14.275，P=0.003，表3，图5)。

表3 流式细胞术凋亡率检测 (%)

*P<0.01

图5 SPAG9 siRNA对肝癌凋亡的影响A.转染SPAG9 siRNA前后流式细胞凋亡检测图，HepG2为未转染组，HepG2i为转染组；B.转染前后HepG2细胞凋亡率分析柱状图;*P<0.01,n=3

讨 论

癌睾丸抗原(cancer-testis antigen CTA)主要表达于正常生殖组织，例如胎盘，卵巢和睾丸，在分化组织中无表达或低表达，在多种人类肿瘤中异常表达，这种异常表达可以解释为“重新表达”，并可作为癌源性细胞的标记[11～13]。SPAG9是CTA家族的新成员，与其他CTA不同的是，SPAG9具有较强的免疫原性，能引起机体体液免疫反应产生自身抗体[14]。文献报道，SPAG9在肿瘤组织中的表达与肿瘤的分期分级相关，恶性肿瘤患者体内SPAG9的表达水平显著高于良性肿瘤患者，且早期肿瘤患者癌组织中SPAG9蛋白表达与血清中SPAG9抗体水平有相关性[15,16]。因此，SPAG9抗体有望作为肿瘤标志物为肿瘤的早期诊断提供参考。

关于SPAG9表达的定位，大多数研究报道主要表达于肿瘤细胞的细胞质[16,17]。然而，笔者的细胞免疫荧光研究结果显示，SPAG9不仅在HepG2细胞的胞质中表达，细胞核中也有表达。笔者的前期研究发现，抑制肝癌QGY-7703细胞中SPAG9蛋白的表达，能够显著抑制细胞的增殖、迁移及侵袭能力[18]。本研究发现特异性抑制HepG2细胞中SPAG9的表达后，HepG2细胞的增殖率显著降低，细胞凋亡率显著增加。这一结果与肝癌QGY-7703细胞的研究结果基本一致，说明SPAG9在肿瘤的形成及发展过程中发挥关键作用。研究显示，抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞系中SPAG9蛋白的表达使细胞周期阻滞于G0/G1期[17]。本研究抑制肝癌HepG2细胞中SPAG9蛋白的表达使细胞周期阻滞于S期，说明在不同的肝癌细胞株中，SPAG9促进肝癌细胞进程的机制可能存在差异，具体机制仍有待于进一步研究。

JNK信号通路是MAPK通路中的一个重要分支，在细胞周期、增殖、凋亡及应激等过程中发挥重要作用，能够促进多种肿瘤细胞的生长。支架蛋白的功能主要是为三级激酶模块的聚集提供物理结构，例如JNK、ERK和p38MAPKs。从结构上看，SPAG9作为支架蛋白，其JBD结构域能够与JNK蛋白相互作用，调控JNK信号通路的活化。研究显示，在星状细胞瘤中，抑制SPAG9蛋白的表达会下调JNK、p-JNK及JunD的表达，JunD能够通过上调cyclinD1、MMP7和MMP9蛋白促进细胞增殖，由此得出，SPAG9促进肿瘤细胞的增殖和迁移可能是通过JNK-JunD信号通路[15]。采用siRNA干扰技术将SPAG9siRNA转入HepG2细胞，发现抑制SPAG9蛋白的表达后，JNK的表达量也随之降低，因此推测，SPAG9能够上调JNK蛋白的表达，从而激活JNK信号通路，在肿瘤的发生、发展中起调控作用。

综上所述，SPAG9在肝癌的形成及发展中发挥重要的调节作用，这种调节作用与JNK信号通路激活有关，而JNK信号通路主要是调控细胞的增殖、周期及凋亡等生理过程，因此，可以通过抑制SPAG9来抑制肿瘤细胞JNK信号的活化，调控肿瘤的形成及发展，SPAG9有望成为肿瘤治疗的新靶点。