夏枯草醇提物抑制肿瘤细胞的研究

杨亚冬 罗 涛 杨 耿 徐怡朦 张文元

夏枯草(Prunella vulgaris L)，为多年生草本植物，匍匐根茎，节上生须根。性寒，味苦、辛。 具有清火明目，散结消肿之功效。夏枯草主要含有三萜及其苷类、甾醇及其苷类、黄酮类、香豆素、有机酸、挥发油及糖类等成分[1,2]。各个成分之间可能存在着协同或抑制的作用，其药理作用广泛，已有较多对于其抗肿瘤机制的研究，主要围绕抑制肿瘤细胞增殖和转移展开。本实验采用水提醇沉法将夏枯草成分分成醇溶出部分和醇沉淀部分，并就这两部分药物对肺癌A549细胞和人肝癌HepG2细胞的增殖抑制作用及其抑制细胞迁移作用进行研究。

材料与方法

1.药品与试剂：夏枯草(符合2015年版《中华人民共和国药典》)购自安徽省亳州市网上药店药掌柜，低糖DMEM培养基(LG - DMEM ，美国Gibco公司)，胰蛋白酶 (美国Sigma公司)，噻唑蓝[MTT，生工生物工程(上海)有限公司]、二甲基亚砜(DMSO)。

2.仪器耗材：CKX41荧光相差倒置显微镜 (日本Olympus公司)，3111型CO2培养箱 (美国Thermo公司)， 酶标仪(美国Thermo公司)，96孔板(美国Corning公司)，25cm2培养瓶(美国Corning公司)细胞株：人肺腺癌细胞系A549细胞为本研究所保存(上海中国科学院细胞库)。人肝癌细胞系HepG2细胞为本研究所保存(上海中国科学院细胞库)。

3.水煮醇沉法提取夏枯草[3,4]:水煮：称取夏枯草生药30g，用去离子水清洗一遍，加40～50℃的去离子水800ml浸泡1h，然后置砂锅内煎，待药液沸腾后，再煎40min倒出煎液，在药渣内再加适量的水煎1次，将两次得的煎液混合，进行加热浓缩至生药含量为0.5g/ml的煎液。静置至室温后用滤纸进行粗滤，收集滤液用于进一步提取。醇沉：将粗滤后的水煎液放恒温磁力搅拌器上80℃加热浓缩药液。待冷却至室温后边搅拌边缓慢加入适量95%乙醇溶液，使乙醇终浓度达到80%以上，4℃冰箱静置过夜，1570×g离心，10min，将沉淀和上清分开。沉淀放平皿里冻干，称重后待用，上清收集后放恒温磁力搅拌器上80℃加热，使乙醇充分蒸发，最后得醇提的浓缩液，生药含量为5g/ml。

4.细胞的准备：分别将A549和HepG2细胞复苏，加L-DMEM完全培养基(含10%胎牛血清、1%抗生素)置37℃、5%二氧化碳培养箱培养，每隔2～3天换液，倒置显微镜观察，待细胞长到80%～90%融合后0.25%胰酶消化，各自传代培养。

5.MTT法检测不同浓度夏枯草提取物对细胞增殖力的影响:分别取A549和HepG2细胞悬液以1×105cells/ml浓度接种96孔板，每孔100μl，培养24h；弃上清，加入配制好的各种浓度的药液，200微升/孔，每个浓度设3个复孔，显微镜观察细胞形态变化，并拍照记录； 48h后，吸弃上清，每孔加入500μg/ml MTT 100μl，37℃静置避光培养4h，弃上清，每孔加入150μl二甲基亚砜；室温振荡10min使沉淀结晶完全溶解，酶标仪490nm波长检测每孔的吸光度A值。根据吸光度计算不同时间不同浓度的中药对细胞的增殖抑制率。实验重复4次，增殖抑制率IR(%)=(实验对照组A值-药物处理组A值)/(实验对照组A值-空白组A值)×100%。

6.细胞划痕法观察药物对细胞迁移能力的影响:将A549和HepG2细胞均以5×104cells/ml分别铺在24孔板中，每孔1ml细胞悬液，培养24h后，形成单细胞层。用10μl移液枪枪头沿着尺子在每孔的中央呈“一”字划痕，用PBS液轻轻冲洗2次，洗去划下来的细胞。实验组中加入不同浓度的夏枯草提取物溶液，夏枯草提取物用不含牛血清的高糖基础培养基(HG-DMEM)进行配制，空白对照组加入HG-DMEM基础培养基。37℃作用24h后，吸去上清，加入含10%牛血清的完全培养基，在培养24h和48h时，显微镜下观察各组细胞向划痕中央迁移生长情况并拍照。

结 果

1.夏枯草提取物浓度计算：夏枯草醇沉淀物浓度按生药量计算为5.0g/ml，夏枯草醇溶解物浓度按生药量计算为5.0g/ml。

2.夏枯草乙醇提取物对肺癌A549细胞和人肝癌HepG2细胞的增殖抑制作用：MTT结果表明，夏枯草醇沉淀物对A549细胞和HepG2细胞的生长增殖抑制作用在浓度为1g/ml时最显著，A值分别为0.174±0.044和0.127±0.006(图1)，两种细胞的增殖抑制率分别为0.826%±0.044%和0.872%±0.006%，细胞的增殖抑制率与药物浓度呈正相关，浓度越高，对细胞的增殖抑制作用越强，增殖抑制率为负数时，表示药物在该浓度对细胞无抑制作用(图2)。夏枯草醇溶解物对A549细胞和HepG2细胞的生长增殖抑制作用并非浓度越高作用越强，而是在浓度为0.1g/ml时最显著，A值分别为0.156±0.022、0.124±0.003(图1)，两种细胞的增殖抑制率分别为84.30%±2.21%、87.41%±0.25%，浓度在0.1～1.0g/ml区间内，药物浓度与两种细胞的增殖抑制率呈负相关，浓度<0.1g/ml后药物对细胞增殖抑制作用迅速减弱，到0.05g/ml时基本无抑制作用(增殖抑制率为负数，表示药物在该浓度对细胞无抑制作用,图2)。

图1 不同浓度夏枯草两种醇提物对A549和HepG2细胞作用48h后A值比较

图2 不同浓度夏枯草两种醇提物对A549和HepG2细胞作用48h后增殖抑制率比较

3.夏枯草乙醇提取物对肺癌A549细胞和人肝癌HepG2细胞作用48h后，细胞形态的变化:A549细胞在药物作用48h后显微镜下可见：夏枯草醇沉淀物浓度为1.0g/ml时细胞呈圆缩状，状态差，浓度为0.5g/ml时，细胞状态较1.0g/ml时好，但仍有不少细胞呈圆缩状，浓度为0.1g/ml时细胞基本恢复正常，均呈贴壁生长，见图3A。夏枯草醇溶解物浓度为1.0g/ml和0.5g/ml时细胞状态良好，但较正常对照细胞数量少，浓度为0.25g/ml时细胞开始出现圆缩状态，浓度为0.1g/ml时更甚，细胞数量也显著减少，浓度为0.05g/ml时细胞又恢复正常的状态，见图3B。细胞状态与MTT结果相符。

HepG2细胞在药物作用48h后显微镜下可见：夏枯草醇沉淀物浓度为1.0g/ml时细胞呈圆缩状，状态差，浓度为0.5g/ml时，细胞状态较1.0g/ml时好，但仍有不少细胞呈圆缩状，浓度为0.1g/ml时细胞基本恢复正常，均呈贴壁生长，见图4A。夏枯草醇溶解物浓度为1.0g/ml和0.5g/ml时细胞状态良好，但较正常对照细胞数量少，浓度为0.25g/ml时细胞数量减少，开始出现圆缩状态，浓度为0.1g/ml时更甚，细胞数量显著减少，浓度为0.05g/ml时细胞又恢复正常的状态，呈现岛状生长，见图4B。

4.夏枯草乙醇提取物对肺癌A549细胞和人肝癌HepG2细胞体外迁移能力的影响:细胞划痕实验结果发现夏枯草醇沉淀物与醇溶解物在浓度为0.5g/ml、0.25g/ml作用细胞24h后，A549细胞在正常培养基条件下培养24h和48h后均未出现细胞垂直于划痕方向增殖迁移。醇沉淀物与醇溶解物浓度为0.1g/ml、0.05g/ml时，A549细胞出现向垂直于划痕方向的增殖迁移。醇溶解物高浓度组未出现细胞迁移，但是细胞状态较低浓度组好，0.1g/ml浓度组虽然出现细胞迁移现象，但细胞出现圆缩，细胞数量显著减少,见图5。

图3 不同浓度夏枯草醇提物作用A549细胞48h后显微镜下观(×100)

图4 不同浓度夏枯草醇提物作用HepG2细胞48h后显微镜下观(×100)

图5 不同浓度夏枯草提取物作用A549细胞24h后，再培养不同时间细胞迁移情况显微镜下观察(×100)

HepG2细胞划痕实验结果发现夏枯草醇沉淀物与醇溶解物在浓度为0.5g/ml、0.25g/ml作用细胞24h后，在正常培养基条件下培养24h和48h后均未出现细胞垂直于划痕方向增殖迁移。醇沉淀物与醇溶解物浓度为0.1g/ml、0.05g/ml时，HepG2细胞出现向垂直于划痕方向的增殖迁移,划痕边线变得不整齐，0.1g/ml浓度时，醇沉物组较醇溶物组细胞迁移生长显著，48h后已经出现划痕基本融合的情况。醇溶解物各组虽然高浓度组未出现细胞迁移，但是细胞形态较低浓度组正常，0.1g/ml浓度组虽然出现细胞迁移现象，但细胞出现圆缩，细胞数量显著减少,见图6。

讨 论

夏枯草所含的化学成分非常复杂，不同提取法获得的成分不同，Lee等[5]用甲醇从夏枯草中分离到了15种三萜类、4种黄酮类、4种酚醛树脂和1个双萜类，各种成分具体发挥什么作用目前尚未有非常明确地定义。其中三萜类、黄酮类、多糖类具有明确地抗肿瘤作用[6～9]。由于其化学成分复杂，其抗肿瘤作用的机制也呈多样性，是中药“多组分，多靶点”的典型代表[10]。可能与调节细胞内Ca2+平衡、维护细胞的稳态和调节细胞周期的变化，抑制肿瘤细胞增殖和转移、调节细胞能量代谢有关[11]。冯春来等[12]通过对夏枯草相关的中药肿瘤通路分析，明确了39种成分能作用于22条肿瘤相关通路，各通路间错综复杂，形成网络状抗肿瘤效果。本实验采用水提醇沉法对夏枯草进行粗提,来研究其成分抗肿瘤细胞的效果，并分析出现该结果可能的因素。

图6 不同浓度夏枯草提取物作用HepG2细胞24h后，再培养不同时间细胞迁移情况显微镜下观察(×100)

水提醇沉法就是利用药物中某些成分能溶于乙醇而某些成分不溶于乙醇的特性初步获得想要的中药成分，在加入乙醇后，部分成分转溶于乙醇中而另外的则被沉淀出来。醇浓度不同，沉淀出来的药物成分不同，通常当含醇量达80%时，几乎可沉淀全部淀粉、多糖、蛋白质、无机盐类物质[13]。本实验用80%的乙醇提取后，将夏枯草水提液分成两部分，沉淀部分主要含有糖类、有机酸盐、各种亲水性的苷类及蛋白质；醇溶出部分主要含有亲脂性成分如三萜皂苷元、甾体苷元、黄酮苷元、香豆素等，并比较研究了这两部分提取物对A549和HepG2细胞的作用。MTT结果显示，夏枯草醇沉淀物对A549细胞和HepG2细胞的生长增殖抑制作用在高浓度1.0g/ml时最显著，均在80%以上，而夏枯草醇溶解物对上述两种细胞的生长增殖抑制作用并非浓度越高作用越强，而是在浓度为0.1g/ml时最显著，醇沉淀物在0.1g/ml这个浓度时，对两种细胞均无抑制作用。醇沉淀物在0.25～1.0g/ml浓度范围内，细胞的增殖抑制率与药物浓度呈正相关，浓度越高，对细胞的增殖抑制作用越强，低于0.25g/ml后基本无抑制作用。醇溶解物浓度在0.1～1.0g/ml区间内，药物浓度与两种细胞的增殖抑制率呈负相关，浓度低于0.1g/ml后药物对细胞增殖抑制作用迅速减弱，到0.05g/ml时基本无抑制作用。

醇溶解物为何会出现中间浓度对细胞增殖抑制作用最强？笔者分析原因可能与中药复杂的多维组分结构有关。中药具有中药物质基础、组分及单体这3个层次的多维组分结构，单体具有明确地化学结构式及明确地药理药效，组分是由同一类别的单体成分构成，组分中各单体成分间存在配伍配比关系，中药物质基础由多个组分构成，各组分间也存在配伍配比关系，所以各个层次中单体或组分结构比例不同会直接影响药理药效[14]。醇溶解物中主要成分是三萜类,还有其他脂溶性成分，刘文博[15]的研究结果中提到夏枯草三萜类生药浓度在0.05～0.4g/ml范围内对A549细胞的增殖抑制作用呈浓度依赖性，浓度越高，抑制作用越强，与醇溶解物在0.05～1.0g/ml浓度范围内呈“V”字型的抑制作用结果不一致，所以可能存在其他成分在同时发挥拮抗效果，且作用效果较三萜类更强，导致在高浓度药物作用下肿瘤细胞反而生长状态良好。岳庆喜等[16]发现三萜类与其他抗肿瘤药物合用效果依赖于该两种药物的作用强度，当一种药物的作用强于另一种时发挥协同作用，当两种药物作用相似时发挥拮抗作用。另一种解释是夏枯草醇溶解物各个单体或组分间的配比在浓度为0.1g/ml时达到了最佳配伍状态，协同发挥出最强的抑制肿瘤细胞增殖的效果。

细胞形态学的结果与MTT结果非常吻合，在增殖抑制率高的组，细胞呈圆缩状，数量上也较正常对照少，在醇沉淀1.0g/ml组和醇溶解物0.1g/ml组细胞状态较其他组都差。这结果提示夏枯草醇沉物和醇溶解物中的有效成分均对细胞有直接的杀伤作用，通过抑制细胞增殖来发挥抗肿瘤作用。

细胞划痕实验又称伤口愈合实验，是检测细胞迁移的一种方法。细胞能感受到“伤口”，并通过重组微管组织中心沿垂直于伤口划痕的方向运动[17]。对于抗肿瘤药物来说，抑制细胞迁移能力越强，表明其抗肿瘤效果越好。实验结果发现夏枯草醇沉淀物与醇溶解物抑制肿瘤细胞迁移能力与浓度呈正相关，浓度越高，抑制效果越强，且不同细胞间抑制效果不同，两种醇提物对A549细胞的抑制迁移效果较HepG2细胞好，同一浓度醇溶解物抑制HepG2细胞的迁移作用较醇沉淀物强，Hwang等[18]研究也证实夏枯草乙醇提取物比水溶解部分的抗氧化效果和抗肿瘤效果更强。实验中发现一个矛盾的现象,在0.05～0.1g/ml浓度范围内，醇溶解物抑制细胞迁移能力与抑制细胞增殖能力不一致，高浓度组未出现细胞迁移，但是细胞状态较低浓度组好，0.1g/ml浓度组虽然出现细胞迁移现象，但细胞出现圆缩，细胞数量显著减少，这一结果表明醇溶解物高浓度时通过抑制细胞迁移较抑制细胞增殖发挥抗肿瘤效果作用强，到0.1g/ml时则反之。这对于患者抗肿瘤用药就是一个福音，因为在这个浓度范围内夏枯草醇溶解物一直能发挥很好的抗肿瘤效果。

综合细胞增殖实验和细胞划痕实验结果，笔者发现醇沉淀物各浓度抗肿瘤效果呈浓度依赖性，浓度越高，通过抑制肿瘤细胞增殖和抑制肿瘤细胞迁移的效果越强。醇溶物MTT结果显示在一定范围内对A549细胞和HepG2细胞的增殖呈“V”字型的抑制作用。