淫羊藿女贞子配伍提高哮喘大鼠对地塞米松作用的敏感度研究

高莹莹 唐秀凤 李晓曦 陈宇恒 于 萍 刘仁慧

哮喘是以气道慢性炎症为特征的呼吸系统的常见疾病之一，目前发生率和致死率逐年上升，并在全世界范围内都严重威胁公众健康[1]。哮喘治疗的首选药物糖皮质激素(glucocorticoids，GC)虽有强大的抗炎作用，但长期或大剂量应用却容易造成严重的难以解决的不良反应[2]。GC作为为甾体激素，发挥抗炎作用的机制是结合胞质内的糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor，GR)，启动基因转录进程，合成相应的发挥抗炎作用的蛋白质[3]。胞质内GR在未被激活时结合2分子的热休克蛋白90(heat shock protein 90，HSP90)，使GR维持预备结合的状态[4]。笔者在前期实验研究中发现，淫羊藿女贞子合用地塞米松对卵蛋白诱导的哮喘大鼠能产生协同抗炎、下丘脑-垂体-肾上腺轴及提高GR的结合力，并证实中药合用布地奈德气道吸入缓解哮喘的机制与调整GR/HSP90的比值有关[5～7]。但对淫羊藿女贞子合用全身给药的GC——地塞米松对GR/HSP90的影响作用尚未明确。

材料与方法

1.实验动物：雄性 SD 大鼠，SPF 级，体重120±10g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物许可证号：SCXK(京)2012-0001。

2.试剂与药品：卵清白蛋白(美国 Sigma公司，A5253-250G)，氢氧化铝(北京化工厂，批号：20120028)，地塞米松磷酸钠注射液(5毫克/支，国药集团容生制药有限公司，批号：H41020036)，HSP 90、GRα一抗，均购自英国Abcam公司，GRβ一抗(biorbyt，E10827)；小鼠抗β-actin抗体、羊抗兔IgG、羊抗小鼠IgG、 DAB显色液均购自中杉金桥，RIPA裂解液(Solarbio，20150517)，Trizol购自美国Invitrogen公司，M-MLV反转录酶、dNTP(10mmol/L)、Ex TaqMix，均由宝生物工程(大连)有限公司提供，引物由上海生工有限公司合成。

3.仪器：402A超声雾化器(江苏鱼跃医疗设备有限公司)，电泳槽(日本TaKaRa公司)，7500型PCR仪(美国ABI公司)，Chromo4荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)，凝胶成像系统(韩国Korea Biotech公司)。

4.动物分组及药物制备方法：42只大鼠随机分为7组，即正常组(N组)、模型组(A组)、地塞米松组(Dex组)、淫羊藿女贞子煎剂组(YN1组)、淫羊藿女贞子煎剂合地塞米松组(YN1&Dex组)、淫羊藿女贞子提取物组(YN2组)和淫羊藿女贞子提取物合地塞米松组(YN2&Dex组)，每组均为6只。淫羊藿女贞子煎液和淫羊藿女贞子提取物制备方法见参考文献[8,9]。

5.造模、给药及取材：参考文献[10]方法于实验第1～35天，除N组外，其他动物进行造模。Dex组、YN1组、YN1&Dex组、YN2组、YN2&Dex组的给药方法同参考文献[11]。第36天处死动物，开胸，取左肺组织，部分4%甲醛固定，其余液氮冻存。

6.检测方法：免疫组化法(immunohistochemistry，IHC)及Western blot(WB)法检测肺组织GRα、GRβ、HSP90的蛋白表达，RT-PCR法检测大鼠的肺组织中GRα、GRβ以及HSP90的 mRNA的表达，具体检测方法同前[4]。详见表1。

表1 GRα、GRβ以及HSP90引物序列

结 果

1. 各组大鼠肺组织中GRα表达的比较：与正常组相比，模型组和地塞米松组的大鼠肺组织中GRα蛋白及mRNA表达量都明显下调(P<0.05或P<0.01)；地塞米松组与模型组相比 GRα mRNA表达量明显降低(P<0.05)。与模型组比较，淫羊藿女贞子单用及淫羊藿女贞子与地塞米松合用均能明显上调GRα 蛋白(WB法检测)及mRNA表达(P<0.05或P<0.01)。与地塞米松组比较，淫羊藿女贞子单用及淫羊藿女贞子与地塞米松合用仍能显著上调GRα 蛋白(WB法检测)及mRNA表达(P<0.05或P<0.01，表2)。

表2 各组大鼠肺组织中GRα表达的比较

与N组比较，*P<0.05，**P<0.01；与A组比较，#P<0.05，##P<0.01；与Dex组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01

2.各组大鼠肺组织中GRβ 表达的比较：与正常组相比，模型组中GRβ 的mRNA表达量明显上调(P<0.05)，地塞米松组GRβ 蛋白及mRNA量均明显上调(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较，地塞米松组GRβ 蛋白的IOD值显著上调(P<0.05)；淫羊藿女贞子提取物组GRβ 蛋白的阳性面积值显著降低(P<0.05)；中药淫羊藿女贞子单用组以及淫羊藿女贞子与地塞米松合用组GRβ mRNA的表达均明显降低(P均<0.01)。与地塞米松组比较，淫羊藿女贞子单用组及淫羊藿女贞子与地塞米松合用组的GRβ 蛋白表达的IOD值和 mRNA的表达都明显降低(P均<0.01)，GRβ 蛋白表达的阳性面积值淫羊藿女贞子提取物合地塞米松组差异无统计学意义，而WB法检测GRβ 蛋白表达是淫羊藿女贞子与合地塞米松的两个合用组比较，差异有统计学意义(P均<0.01，表3)。

表3 各组大鼠肺组织GRβ 表达的比较

与N组比较，*P<0.05，**P<0.01；与A组比较，#P<0.05，##P<0.01；与Dex组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01

3.各组大鼠肺组织中HSP90表达的比较：与正常组比较，模型组表达的HSP90蛋白和mRNA均明显降低(P<0.01)；地塞米松组HSP90蛋白(IOD值及WB法检测)及mRNA表达也显著降低(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较，地塞米松组各值差异无统计学意义(P均>0.01)；其余给药组HSP90蛋白(阳性面积值及WB法检测值)及mRNA的表达均显著升高(P<0.05或P<0.01)。与地塞米松组比较，淫羊藿女贞子单用及淫羊藿女贞子与地塞米松合用共4组均能显著上调HSP90蛋白(WB法检测值)及mRNA的表达(P<0.05或P<0.01)，淫羊藿女贞子提取物与地塞米松合用组对IHC法检测的HSP90蛋白含量均明显上调(P<0.05,表4)。

表4 各组大鼠肺组织HSP90表达的比较

与N组比较，*P<0.05，**P<0.01；与A组比较，#P<0.05，##P<0.01；与Dex组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01

4.各组大鼠肺组织GRα/GRβ的比较：与正常组比较，模型组及地塞米松组GRα/GRβ 比值在蛋白及mRNA水平均显著降低(P均<0.01)。分别与模型组和地塞米松组比较，淫羊藿女贞子与地塞米松两个合用组在蛋白及mRNA水平上均可上调GRα/GRβ比值(P<0.05或P<0.01,表5)。此外，相关分析结果显示， GRα 与GRβ 在蛋白及mRNA水平的相关系数r值分别为-0.566(P=0.000)和-0.495(P=0.001)。

表5 各组大鼠肺组织GRα/GRβ的比较

与N组比较，*P<0.05，**P<0.01；与A组比较，#P<0.05，##P<0.01；与Dex组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01

5.各组大鼠肺组织GR亚型/HSP90的比较：与正常组比较，模型组GRα/HSP90在mRNA水平及HSP90/GRβ在蛋白水平均明显降低(P均<0.01)；地塞米松组GRα/HSP90 在mRNA水平及GRβ/HSP90在蛋白及mRNA水平均显著降低(P均<0.01)。分别与模型组及地塞米松组比较，淫羊藿和女贞子的单用、淫羊藿女贞子与地塞米松合用组均能调整GRα/HSP90、GRβ/HSP90在mRNA水平上的比值(P均<0.01)；淫羊藿女贞子与地塞米松合用组能显著抑制GRβ/HSP90在蛋白水平的比值(P<0.05或P<0.01)。此外，相关分析结果显示， HSP90与GRα 在蛋白及mRNA水平的r值分别为0.708(P=0.000)和0.535(P=0.000)；HSP90与GRβ 在蛋白及mRNA水平的r值分别为-0.476(P=0.004)和-0.368(P=0.019,表6)。

表6 各组大鼠肺组织HSP90/GR亚型的比较

与N组比较，*P<0.05，**P<0.01；与A组比较，#P<0.05，##P<0.01；与Dex组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01

讨 论

哮喘的发病机制与GR损伤有关，包括GR的数量下降、结构缺陷以及基因表达调控的改变等[12]。而使用外源性GC，会使GR的缺陷更加严重，表现为哮喘患者对激素的反应性下降。GR有两种主要的亚型，GRα 和GRβ。GRα 可激活经典激素效应，而GRβ不直接与GC结合，而是与GRα 存在拮抗关系起作用[13]。GRβ表达的增加与GC敏感度降低有明确关系[14，15]。GC 抵抗的发生可能是与GRα 与GRβ 比值失衡有关[16]。笔者研究发现，哮喘模型及地塞米松组GRα 蛋白和mRNA表达均明显降低，哮喘模型组GRβ mRNA表达显著上调，地塞米松组GRβ 蛋白及mRNA表达均明显上调。哮喘大鼠经地塞米松治疗后GRβ蛋白表达的上调提示哮喘大鼠对激素作用的敏感度降低，可能增加了GC抵抗的发生。而哮喘大鼠被给予地塞米松合用淫羊藿女贞子煎液或提取物治疗后，GRα 的表达明显增加，且GRβ 的表达被抑制，调整GRα/GRβ 的比值，提示改善GR亚型的表达及GRα/GRβ的失衡状态，可能是中药提高哮喘大鼠对激素作用敏感度的部分机制。

热休克蛋白HSP90是GR的分子伴侣，可以激活GR使其发挥作用。在正常情况下，HSP90可以改变GR的立体构象，使GR形成能与GC结合的特异性构象，从而使GR可与GC结合。也就是说HSP90与GR的配体的结合域结合后，GR才能与GC高效联结发挥作用。所以HSP90减少，会使GR上与GC结合的位点的立体结构不能与GC特异性结合，虽然有证据表明不与HSP90结合的GR也可以接受GC刺激，但对于GC的敏感度是降低的[17]。

HSP90不仅是能使GR激活成可结合状态使其顺利发挥作用，即HSP90的存在可增加类固醇激素的敏感度；另一方面在激活GR后，HSP90对GC的作用效果也起到调节作用 ，即当HSP90与GR之比适当时，可增加GC的作用效果；而HSP90与GR之比不在正常范围内则可以降低GC的作用效果。本研究数据结果显示，哮喘模型组HSP90的蛋白表达量和其mRNA表的达量均明显下调，同时GRα与 HSP90 的mRNA量之比明显降低，而GRβ/HSP90比值显著升高。淫羊藿女贞子煎剂和水提物与地塞米松合用后，HSP90 表达显著上调，GRα/HSP90 或GRβ/HSP90均有显著的改善。提示中药淫羊藿女贞子调整哮喘大鼠对GC作用的敏感度与上调HSP90 表达，调整GR亚型与HSP90的比值有关。