祛风舒筋丸对佐剂关节炎大鼠免疫调节及血管内皮生长因子、细胞黏附分子-1表达的影响

张瑶，屠莹，胡占嵩，陈丽娟

类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis， RA)为自身免疫性疾病，全世界发病率约0.5%～1%，我国发病率约0.4%，女性的发病率高于男性[1-2]。该病以关节滑膜慢性炎症以及软骨和骨的破坏为其主要特点[3]，可导致关节畸形和功能丧失，影响病人的生活质量。类风湿性关节炎属于中医理论中“痹症”范畴，发病初期因风寒湿邪侵入经络关节，导致气血不通，故为风寒湿痹型，以祛风散寒，利湿宣痹等功效中药施治[4]。祛风舒筋丸目前收载于2015版《中国药典》[5]，该药由防风、牛膝、秦艽、威灵仙等十八味中药制成，有祛风散寒，除湿活络之功效，用于治疗风寒湿闭阻所致的关节疼痛、屈伸不利、四肢麻木等症状。目前对祛风舒筋丸研究多为质量标准的建立[6]，对其抗类风湿性关节炎的作用机制研究鲜有报道。大鼠弗氏完全佐剂性关节炎模型的发病机制和特征与临床上的类风湿性关节炎较为接近[7]，本研究自2016年10月至2017年3月通过佐剂性关节炎大鼠模型，探究祛风舒筋丸对模型大鼠的免疫调节作用以及对血管内皮生长因子(VEGF)与细胞黏附分子-1(ICAM-1)表达的影响，为该药用于类风湿性关节炎的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1实验动物雄性健康SD大鼠，体质量(250±20)g，清洁级动物，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号 SCXK-(京)-2016-0011。本研究中对于大鼠的处理符合动物伦理学标准。

1.2药物及试剂祛风舒筋丸(北京宝树堂科技药业有限公司，规格60 g/100丸)；弗氏完全佐剂(美国Sigma公司)；白芍总苷胶囊(宁波立华制药有限公司，0.3 g/粒)；刀豆蛋白A(Con A)、脂多糖(LPS)、噻唑蓝(MTT)(美国Sigma公司)；RPMI1640培养粉(美国Gibco公司)；多聚甲醛、二甲基亚砜(天津光复化学试剂有限公司)；0.9%氯化钠注射液(天津百特医疗用品有限公司)；风湿因子(RF)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒(南京建成科技有限公司)；VEGF、ICAM-1免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

试剂配制：将生理盐水和弗氏完全佐剂在临用配制前充分摇匀。取适量生理盐水与弗氏完全佐剂经双注射器充分乳化1 h(经三通接口反复抽推乳化成油包水乳剂)，配置成 10 mL 的弗氏完全佐剂生理盐水乳剂。

1.3实验仪器超净工作台(天津艾克瑞特实验室设备有限公司)；细胞培养箱(美国 Thermo Electron 公司)；酶标仪(美国BIOTEK公司)；小型台式冷冻离心机(美国Thermo Scientific公司)。

1.4方法

1.4.1大鼠佐剂性关节炎模型的建立 取雄性健康SD大鼠，体质量(250±20) g，自由饮食、饮水，适应性饲养1周后开始实验。在进行酒精常规消毒左足趾和尾根部后，用微量注射器于每只大鼠左后足足趾皮下注射 0.1 mL 的弗氏完全佐剂生理盐水乳剂，尾根部多点皮内注射上述乳剂 0.1 mL 致炎，空白组(随机取10只大鼠)用同样方法于其相应部位注射 0.2 mL 生理盐水。分别于初次造模第6天和第12天后注射乳剂0.2 mL以加强免疫炎症反应，建立大鼠佐剂性关节炎模型。造模后第12天，按照关节红肿程度进行关节炎指数(Arthritic Index， AI)的评分[8](评分标准：0分，无关节红肿；1分，关节发红而不肿胀；2分，关节轻度红肿；3分，关节中度红肿；4分，关节重度红肿，不能负重。AI=四肢关节评分之和。各组评分>4分认为造模成功，AI<4分的大鼠从实验组中剔除)。将造模成功的大鼠采用随机数字表法分为5组，即模型组、白芍总苷胶囊组、祛风舒筋丸低、中、高剂量组，每组10只，共计50只。在造模后的第12天分别测量并记录左后足趾厚度后，灌胃给药。白芍总苷胶囊组给药剂量为0.27 g/kg，祛风舒筋丸低、中、高剂量组(2.16、10.8、21.6 g/kg，相当于临床等效剂量的1、5、10 倍)，每只大鼠灌胃2 mL，空白组和模型组给予等量生理盐水，共给药18 d。

1.4.2祛风舒筋丸对佐剂性关节炎大鼠关节肿胀度的影响 在造模前及给药治疗前后观察各组大鼠活动状态变化及关节红肿情况，于造模前、造模后第12天、造模后第17天、造模后第21天、造模后第25天、造模后第29天用游标卡尺测量左后足趾厚度，比较治疗后各组足趾肿胀程度的变化。计算：肿胀度=造模后足趾厚度-造模前足趾厚度。

1.4.3祛风舒筋丸对大鼠脾淋巴细胞增殖的影响 实验第30天，即给药18 d后眼球放血处死大鼠，无菌取脾，制备脾细胞悬液，常规制备单个脾细胞悬液，活细胞大于95%，调整细胞浓度为1×107个/mL，加入96 孔培养板，每孔加细胞悬液100 μL，再加入含Con A 或LPS的RPMI-1640液100 μL(Con A的终浓度为5 mg/L，LPS的终浓度为10 mg/L)，在37℃，5% CO2的培养箱中培养48 h，每孔滴加MTT(5 mg/mL)20 μL后继续培养4 h，去上清液后滴加二甲基亚砜200 μL，于酶标仪570 nm 处比色测定吸光度值。

1.4.4大鼠血清RF、IL-1β、IL-6及TNF-α的检测 实验第30天眼球放血处死大鼠，将全血以3 000转/分钟离心，取血清，-20 ℃保存，按照ELISA试剂盒说明书方法测量血清RF、IL-1β、IL-6以及TNF-α的含量。

1.4.5大鼠滑膜组织VEGF及ICAM-1蛋白表达的检测 实验第30天，即给药18 d后处死大鼠，仰位固定，酒精消毒处理，去皮毛及肌腱组织，打开膝关节腔可见滑膜组织，将其剥离并放入4%多聚甲醛中固定2 h，经梯度酒精逐级脱水，石蜡包埋，按VEGF及ICAM-1免疫组化试剂盒的具体步骤操作。

2 结果

2.1祛风舒筋丸对佐剂性关节炎大鼠关节肿胀度的影响各实验组于弗氏完全佐剂三次致炎造模后第12天给药，致炎造模后，各组大鼠足趾均明显肿胀。造模后第12、17天祛风舒筋丸高、中剂量组的足趾厚度均与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)。造模后第21、25、29天祛风舒筋丸高、中剂量组的足趾厚度均与模型组相比差异有统计学意义(P<0.01)，低剂量组的足趾厚度与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)，且高剂量组显示了持续稳定的足趾肿胀抑制作用，效果与白芍总苷组接近，结果见表1。

2.2祛风舒筋丸对佐剂性关节炎大鼠脾淋巴细胞增殖的影响本研究分别采用Con A诱导的大鼠T淋巴细胞增殖和LPS诱导的B淋巴细胞增殖实验来评价祛风舒筋丸对佐剂性关节炎大鼠脾淋巴细胞增殖的影响和对免疫功能的调节作用。模型组吸光度与空白组相比差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，祛风舒筋丸高剂量组和白芍总苷组分别对Con A和LPS诱导的T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖能力有抑制作用，差异有统计学意义(P<0.01)，且与白芍总苷组接近；中、低剂量组对淋巴细胞增殖能力亦有一定的抑制作用，差异有统计学意义(P<0.05)，结果见表2。

表1 祛风舒筋丸对佐剂性关节炎大鼠关节肿胀度的影响

注：整体分析为两因素重复测量方差分析。两两组间比较为LSD-t检验，与模型组比较，aP<0.05，bP<0.01

表2 祛风舒筋丸对佐剂性关节炎大鼠T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖的影响

注：与模型组比较，aP<0.05，bP<0.01；与空白组比较，cP<0.05，dP<0.01

2.3大鼠血清RF、IL-1β、IL-6及TNF-α含量的检测研究证实RF 以其高敏感性作为临床上类风湿关节炎的损伤程度及病情预后判断的重要指标[9]。IL-1β、IL-6及TNF-α等细胞炎性因子的表达失衡是RA发病的重要因素[10-11]。实验结果显示与模型组比较，祛风舒筋丸高剂量组和白芍总苷组能极显著降低佐剂性关节炎大鼠血清RF、IL-1β、IL-6及TNF-α的含量(P<0.01)，祛风舒筋丸中、低剂量组能显著降低佐剂性关节炎大鼠血清RF、IL-1β、IL-6及TNF-α的含量(P<0.05)，且呈现出明显的剂量依赖性，结果见表3。

2.4大鼠滑膜组织VEGF和ICAM-1表达的检测

本研究采用免疫组化检测大鼠关节滑膜组织中VEGF与ICAM-1的蛋白表达，实验结果显示与模型组比较，祛风舒筋丸高剂量组和白芍总苷组能极显著降低佐剂性关节炎大鼠滑膜组织VEGF与ICAM-1蛋白的表达(P<0.01)，中、低剂量组能显著降低VEGF与ICAM-1蛋白的表达(P<0.05)，且对表达的抑制作用呈现出明显的剂量依赖性，结果见表4。

表3 祛风舒筋丸对佐剂性关节炎大鼠血清RF、IL-1β、IL-6及TNF-α的影响

注：与模型组比较，aP<0.05，bP<0.01；与空白组比较，cP<0.05，dP<0.01

表4 祛风舒筋丸对佐剂性关节炎大鼠滑膜组织VEGF和ICAM-1表达的影响

注：与模型组比较，aP<0.05，bP<0.01；与空白组比较，cP<0.05，dP<0.01

3 讨论

RA以关节滑膜慢性炎症为主要表现，病灶中的滑膜细胞持续释放细胞因子，造成增生异常并导致病变[12]。本研究中在造模后期(第21～29天)，祛风舒筋丸的中、高剂量组大鼠足跖肿胀均有所减轻，与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.01)，高剂量组的效果与白芍总苷组接近，该实验结果符合该动物模型的特点，证实祛风舒筋丸可以相对延缓类风湿关节炎病人症状的后期进展，在提高生活质量方面有着积极的作用。

淋巴细胞转化实验是是采用体外刺激物(Con A等)刺激淋巴细胞，使其体积增大，蛋白与核酸合成增加并转化为具有分裂能力的淋巴母细胞。淋巴细胞转化率可用来判断药物对机体的细胞免疫调节作用[13]。RA作为一种自身免疫性疾病，始于致病抗原被T细胞所识别和激活，继而引发T细胞增殖和B细胞的活化增殖，导致滑膜新生血管形成，产生细胞因子[14]。实验研究显示祛风舒筋丸可以显著抑制佐剂性关节炎大鼠Con A诱导的T淋巴细胞增殖和LPS诱导的B淋巴细胞增殖，且作用有剂量依赖性，说明祛风舒筋丸可通过抑制T淋巴和B淋巴细胞增殖从而抑制模型大鼠的细胞免疫功能。

RA属于血管增生性疾病，其基本病理变化为滑膜炎和血管翳的形成，其中包括多种细胞因子、抗原抗体及粘附分子参与[19]。VEGF为目前已知作用最强，特异性最高的血管生长因子[20]，可以特异性地促进血管内皮细胞增殖与迁移，促进血管翳的形成。ICAM-1可导致滑膜细胞的移行增生，在细胞激活过程中提供辅助刺激因子，使白细胞停滞在炎症局部[21]。因此关节滑膜组织中VEGF与ICAM-1的表达水平可以反映炎症的变化程度。研究发现祛风舒筋丸高、中、低剂量组均能显著降低VEGF与ICAM-1蛋白的表达，且对表达的抑制作用呈现出明显的剂量依赖性，推测该药可能通过抑制VEGF和ICAM-1的表达，从而阻断滑膜血管新生和血管翳形成，阻止巨噬细胞和淋巴细胞向局部移行，抑制关节滑膜慢性炎症的产生。

综上所述，祛风舒筋丸抗类风湿关节炎作用机制可能与抑制T淋巴和B淋巴细胞增殖调节细胞免疫，抑制IL-1β、IL-6及TNF-α等细胞因子生成，抑制VEGF和ICAM-1的表达阻断滑膜血管新生，抑制炎症细胞浸润与渗出有关。