红曲菌发酵黄精渣生产monacolin K的探索性研究

陈小林，南海珍，徐志南

(1.杭州德润全健康产业发展有限公司，浙江 杭州 311500；2.浙江大学化工与生物工程学院生物工程研究所，浙江 杭州 310027)

黄精是我国常用的中药材，为百合科黄精属多年生草本植物根茎的总称，全球有60 余种，主要分布于北温带和北亚热带，我国有31种，黄精含有多种化学成分，主要包括多糖、甾体皂苷、三萜、生物碱、木脂素、黄酮、植物甾醇及挥发油等，其中多糖和甾体皂苷类成分在黄精中含量较大，为其主要药效成分[1]。有关黄精的记载始见于《名医别录》，其性味甘、平，归脾、肺、肾经，黄精在降血糖和免疫调节、抗肿瘤、提高学习和记忆能力以及预防心脑血管疾病等方面均有不错的效果[2-3]。目前黄精的应用主要通过蒸煮炮制后，获得黄精提取物后,作为中药饮片应用于临床或者中成药的生产。提取后的黄精渣一般都做丢弃处理，这在一方面带来了环境问题，另一方面对黄精资源也是一大浪费。

红曲属物种是非致病性真菌，红曲菌发酵能产生多种具有生理活性的次生代谢产物，主要有红曲色素、monacolin K、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)[4]。许多研究表明有些红曲霉属的次生代谢物在改善高脂血症、高血压、高血糖、阿尔茨海默病发展有一定的作用[5]。Monacolin K 最早是于1979 年由日本学者远腾章教授在红曲菌中发现的[6]。Monacolin K也称为洛伐他汀，是红曲霉生物活性代谢产物之一，洛伐他汀是一种3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶的抑制剂，能降低血清甘油三酯和总胆固醇，因此monacolin K已被广泛用作降低血液胆固醇的有效药物，是美国畅销的药物之一[7]。Monacolin K还可以抑制人类恶性胶质瘤细胞生长，降低小鼠肺癌细胞的转移[8]。Monacolin K结构式见图1。

图1 monacolin K的结构式

许多的研究发现，固态发酵(SSF)有一些生物技术上的优点，例如更高的发酵生产力，更高的产物终浓度和较低的分解代谢抑制[9]。对于SSF中的monacolin K生产，最常用的底物是水稻，一些其他底物，如大豆、花生、甘蔗渣、小米、马铃薯可以用于monacolin K生产[10-11]。本研究以黄精渣为底物中的一种用来发酵生产monacolin K，研究物料含水量、黄精渣加入量、米粉加入量、黄豆粉加入量、发酵时间等因素对monacolin K产量的影响，以提高产量，避免黄精渣的丢弃所产生的环境问题，降低成本。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 紫色红曲菌(Monascuspurpureus325)：杭州桐君堂生物科技有限公司；黄精(浙江桐君堂药业有限公司)；洛伐他汀(Lovastatin，中国食品药品检定研究院)；大米、黄豆、麸皮为市售。

红曲菌液态培养基：葡萄糖4%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%。

1.2 仪器与设备 高效液相色谱仪(德国Waters 2695)，检测器为Waters 2996；分析天平(Mettler Toledo Ax205)；HZQ-F280全温振荡培养箱(太仓市华美生化仪器厂)；SPX-250B-Z生化培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；GR-B2074FNA冰箱(泰州乐金电子冷机有限公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 Monacolin K的检测方法 取样品粉碎过筛，精密称量，加入50%乙醇提取，摇匀，超声提取(功率250 W，频率40 kHz)30 min，取出后冷却，用50%乙醇补足到刻度，取滤液用有机膜过滤即得待测液。对照品溶液：取lovastatin适量，精密称量，用乙腈配成每毫升含有40 μg的溶液。即得。

流动相：乙腈∶甲醇∶0.1%磷酸溶液=55∶5∶40；检测波长为238 nm；流速 1 mL·min-1； 进样量10 μL。

1.3.2 固态发酵方法 见图2所示。

图2 黄精渣固体发酵生产monacolin K流程简图

2 结果与分析

2.1 发酵温度对红曲菌发酵黄精渣产monacolin K的影响 取黄精渣300 g，拌入米粉150 g，黄豆粉150 g，搅拌均匀，使其含水量达到40%。随后装入发酵瓶中，每瓶装量200 g，121 ℃，灭菌45 min。冷却后接种红曲液态中20 mL，在22、25、28、31 ℃下发酵15 d，倒出物料，干燥后测定其中的monacolin K含量。试验结果如图3所示。

图3 发酵温度对monacolin K产量的影响

由图3中趋势可知，随着温度的升高，monacolin K的产量先增后降，22 ℃～25 ℃时，随着温度升高，monacolin K产量不断提高，在25 ℃达峰值5.45 mg·g-1，随后温度升高，产量下降，因此在25 ℃条件下发酵相对来说比较合适。

2.2 黄精渣含量对红曲菌产monacolin K的影响 分别称取黄精渣500、600、700、800、900 g，分别拌入米粉和黄豆粉为1∶1的混合粉500、400、300、200、100 g，使黄精渣含量分别为50%、60%、70%、80%、90%；搅拌均匀，控制其含水量为40%。随后装入发酵瓶中，每瓶装量200 g，121 ℃，灭菌45 min。冷却后接种红曲液40 mL，在25 ℃下发酵15 d后倒出物料，物料干燥后测定其中的monacolin K含量。试验结果如图4所示。

图4 黄精渣含量对monacolin K产量的影响

从图4可看出，随着黄精渣含量的变化，monacolin K的产量先增后降，当黄精渣含量分别在60%和70%时，monacolin K的含量分别为5.865和5.832 9 mg·g-1，产量相差不明显，但是黄精渣含量在60%左右时，monacolin K的含量的标准偏差较大，因此在黄精渣含量对红曲菌产monacolin K的影响试验中，选取黄精渣含量为70%时较为合适。

2.3 含水量对红曲菌发酵黄精渣产monacolin K的影响 取黄精渣700 g，拌入米粉150 g，黄豆粉150 g，搅拌均匀，调节其含水量分别为30%、35%、40%、45%、50%。随后装入发酵瓶中，每瓶装量200 g，121 ℃，灭菌45 min。冷却后接种红曲液40 mL，在25 ℃下发酵15 d，倒出物料，干燥后测定其中的monacolin K含量。试验结果如图5所示。

图5 含水量对monacolin K产量的影响

由图5可知，monacolin K产量随着含水量的增加，呈现先增后降的趋势，在含水量为35%时候，monacolin K产量达到峰值6.51 mg·g-1，但是数据的标准偏差相对较大，操作过程中存在一定的试验误差，同时35%的含水量的条件下物料稍显干硬。有学者发现物料因干燥而松散，不利于菌体的生长[12]，当含水量为40%时，monacolin K产量相对较好可达到4.85 mg·g-1，此时物料不黏连成块且不显干燥,发酵过程平稳,有利于菌体生长。当含水量为50%时，发酵的底物结块严重，monacolin K产量低。综上可知虽然40%的含水量条件下发酵得到的monacolin K产量的标准偏差比35%含水量的数值稍低，但是在综合考虑试验误差、菌体生长以及产物产量的情况下，选取当含水量为40%较为合适。

2.4 黄豆粉与米粉配比对红曲菌发酵黄精渣产monacolin K的影响 控制黄精渣的含量为70%(取黄精渣700 g，其余300 g)，按照黄豆粉：米粉比例为1∶1,1∶2,1∶3,1∶4,2∶1加入，调节其含水量为40%，随后装入发酵瓶中，每瓶装量200 g，121 ℃，灭菌45 min。冷却后接种红曲液40 mL，在25 ℃下发酵15 d，倒出物料，物料干燥后测定其中的monacolin K含量。试验结果如图6所示。

图6 黄豆粉与米粉配比对monacolin K产量的影响

由图6可知，monacolin K的产量随着米粉的增加呈现出先增后降的趋势，当黄豆粉与米粉的比例为1∶2时，monacolin K的产量可以达到峰值5.29 mg·g-1，但是它的标准偏差相对较大，当黄豆粉与米粉比例达到1∶1时，monacolin K的产量达到4.05 mg·g-1。在本试验之前因为不确定最佳配比，所以试验操作中一直采用黄豆粉与米粉配比为1∶1的比例来进行试验，综合考虑成本与monacolin K产量的因素后，选取黄豆粉与米粉的配比为1∶1进行后续试验。

2.5 发酵时间对红曲菌发酵黄精渣产monacolin K的影响 取黄精渣700 g，拌入米粉150 g，黄豆粉150 g，搅拌均匀，使其含水量达到40%。装入发酵瓶中，每瓶装量200 g，121 ℃，灭菌45 min。冷却后接种红曲液态中40 mL，在25 ℃条件下分别发酵5、10、15、20、25、30 d，倒出物料，干燥后测定其中的monacolin K含量。试验结果如图7所示。

图7 发酵时间对monacolin K产量的影响

由图7可知，随着发酵时间的增加，monacolin K的产量也一直增加，发酵前15 d基本呈现线性增加，发酵第15天时，monacolin K产量可达到5.95 mg·g-1；在15～30 d之间，monacolin K大量产生，当发酵30 d后，monacolin K含量可达到16.21 mg·g-1，红曲霉利用黄精渣进行固态发酵30 d较为合适。

3 结论

通过研究发酵温度、黄精加入量、含水率、米粉和黄豆粉的配比和发酵时间对monacolin K产量的影响，结果表明当含水量为40%、黄精加入量为70%，米粉与黄豆粉加入量为1∶1，在25 ℃下发酵30 d，monacolin K的产量可以达到16.21 mg·g-1。这一工作表明，红曲霉能够很好利用黄精渣进行固

态发酵，并产生较高的monacolin K，这一研发工作对黄精产业深加工和开发下游的黄精系列产品都具有重要的指导意义。