虾青素的毒理学安全性评价研究

石丽丽，韩 超，赵金鹏，李 岩

(中国疾病预防控制中心营养与健康所，北京 100050)

虾青素是一种在自然界中广泛存在的天然抗氧化剂，其分子结构中具有很长的共轭双键链以及不饱和的酮基和羟基，能够有效清除自由基和淬灭活性氧，使其具有较强的抗氧化活性[1]。研究表明，虾青素还具有增强免疫力、抗炎抗感染、抑制肿瘤、降血糖、预防心血管疾病以及预防老年痴呆等多种有益作用[2-5]。因此，虾青素在营养保健食品、食品添加剂和医药产品等多个领域均具有广阔的市场前景。本研究采用急性毒性试验、遗传毒性试验、大鼠30d喂养试验等毒理学评价方法，旨在对虾青素的食用安全性进行评估，为虾青素产品在保健食品和食品添加剂等领域的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

受试物：虾青素软胶囊的内容物为红棕色油状液体，人体推荐量为1g/d，即每天0.016 7g/kg·BW(成人按60kg体重计)。

1.2 实验动物和饲料条件

SD大鼠(SPF级)、昆明种小鼠(SPF级)均购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，许可证号为SCXK-(军)2012-0004。饲养地点为中国疾病预防控制中心动物房和中国医学科学院医学实验动物研究所动物房，许可证号为SYXK(京)2014-0043、SYXK(京)2013-0019，实验室为屏障环境，温度20～24℃，相对湿度40%～70%，实验动物试验前在动物房环境中适应3d。

1.3 试验菌株

试验菌株为鼠伤寒沙门菌TA97、TA98、TA100、TA102。

1.4 试验方法

1.4.1急性经口毒性试验 健康SD大鼠20只，雌雄各半，体重180～220g，采用最大耐受量(MTD)法。实验前动物隔夜空腹(禁食16h，不限制饮水)，以样品原液直接灌胃给予动物，样品的质量体积比为0.950g/mL，以10.0mL/kg·BW灌胃量进行灌胃，灌胃2次，受试物给予剂量为19.0g/kg·BW。观察期14d，记录动物中毒症状及死亡情况。

1.4.2Ames试验 采用平板掺入法，使用鉴定合格的TA97、TA98、TA100、TA102菌株，S9混合液为体外代谢活化系统。称取受试物1.0g，以0.103MPa、20min高压灭菌后，加灭菌DMSO定容至20mL，浓度为5 000μg/皿，作为最高剂量组。试验剂量为5 000、1 000、200、40、8μg/皿，另设空白对照组、溶剂对照组和阳性对照组，阳性物包括2-氨基芴、甲基磺酸甲酯、1，8-二羟基蒽醌和敌克松，每个组别设3个平行皿。此试验重复2次，若受试物的回变菌落数是溶剂对照组的2倍以上，且具有剂量反应关系者则为阳性。

1.4.3小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验 选用昆明小鼠50只，体重25～30g。实验按照一次性最大灌胃剂量方法进行剂量设计，3个剂量组分别为2.38、4.75、9.50g/kg·BW，另设阴性对照组和环磷酰胺阳性对照组(40mg/kg·BW)。采用间隔24h两次经口灌胃法进行试验，按10mL/kg·BW灌胃，第二次给予受试物6h后颈椎脱臼处死动物，取胸骨骨髓制片。每只小鼠计数200个嗜多染红细胞(PCE)，计算嗜多染红细胞与成熟红细胞的比值(PCE/NCE)；并观察1 000个PCE中含微核的细胞数，统计微核发生率。

1.4.4小鼠精子畸形试验 选用健康性成熟雄性昆明小鼠30只，体重25～35g。按照一次性最大灌胃剂量方法进行剂量设计，3个受试物剂量组分别为2.38、4.75、9.50g/kg·BW，另设溶剂对照组和环磷酰胺阳性对照组(40mg/kg·BW)。灌胃量为10mL/kg·BW，连续5d给予受试物。实验第35天，颈椎脱臼处死小鼠，取两侧附睾精子滤液制片、镜检。每只小鼠计数1 000个精子，并计算精子畸形率。

1.4.5大鼠30d喂养试验 选用健康断乳SD大鼠80只，设对照组和3个剂量组，每组20只，雌雄各半。根据样品的人体推荐量设立3个剂量组，分别为0.418、0.835、1.670g/kg·BW，灌胃量为4mL/kg·BW。称取41.75g受试物，食用植物油定容至100mL作为高剂量组，中、低剂量组依次以食用植物油2倍倍比稀释，各剂量组终浓度分别为417.5、208.8、104.4mg/mL。对照组灌胃给予相同体积的食用植物油。试验期间，每天观察并记录动物的生长状况，每周称2次体重，记录每周进食量并计算食物利用率。30d后麻醉腹主动脉取血检测血液学和血液生化学检查。对每只动物进行大体解剖，肝、肾、脾和睾丸(卵巢)进行称重，计算脏体比。对照组和高剂量组的肝、肾、脾、胃、十二指肠和睾丸(卵巢)进行组织病理学检查。

1.5 数据统计分析

采用SPSS软件进行数据统计，微核试验采用泊松分布检验统计，精子畸形试验采用卡方检验，大鼠30d喂养试验采用方差分析，以α=0.05作为显著性水平。

2 结果与分析

2.1 急性毒性试验

虾青素以19.0g/kg·BW剂量灌胃给予大鼠，14d内未见实验动物出现中毒症状和死亡情况，表明虾青素对雌、雄两种性别的大鼠的急性毒性最大耐受剂量均大于19.0g/kg·BW，属于无毒级。

2.2 遗传毒性试验

2.2.1数据统计分析 采用Ames试验在加S9与不加S9的情况下，各实验组在相同实验条件下重复2次，结果表明，虾青素各剂量组的回变菌落数都未超过自发回变菌落数的2倍，亦无剂量反应关系。因此，虾青素对鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100、TA102不具有致突变作用。

2.2.2小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验 与阴性对照组相比，虾青素各剂量组嗜多染红细胞(PCE)与成熟红细胞(NCE)的百分比并未低于20%，说明在此实验剂量下虾青素未表现出细胞毒性。与阴性对照组相比，环磷酰胺阳性组的微核率显著升高(P<0.01)，而各剂量组的微核率并未出现显著性差异(P>0.05)，结果表明，虾青素对小鼠骨髓嗜多染红细胞未产生致突变作用(表1)。

表1 小鼠骨髓细胞微核试验结果

注：与阴性对照组相比，* *P<0.01

2.2.3小鼠精子畸形试验 与阴性对照组相比，虾青素各剂量组的精子畸形率无显著性差异(P>0.05)，而环磷酰胺阳性组与阴性对照组相比具有显著性差异(P<0.01)，说明虾青素对小鼠精子无致畸作用(表2)。

表2 精子畸形试验结果

注：与阴性对照组相比，* *P<0.01

2.3 大鼠30d喂养试验

2.3.1生长状况及食物利用率 实验期间，各组动物活动正常，无明显中毒症状，生长发育良好。与对照组相比，各剂量组动物体重、增重、进食量和食物利用率均无显著性差异(P>0.05)(表3)。

表3 虾青素软胶囊对大鼠体重、食物总摄入量和食物利用率的影响

注：与对照组相比，P>0.05

2.3.2血液学指标 实验末期，各剂量组血液学指标与对照组比较，1.670g/kg·BW剂量组雌性大鼠单核细胞百分比明显升高(P<0.05)，但此指标的差异在本实验室对照组历史正常检测范围内，且剂量组之间无剂量反应关系，因此上述差异无生物学意义，其余各剂量组血液学指标与对照组相比均无显著性差异(P>0.05)(表4～5)。

表4 虾青素软胶囊对大鼠血液学的影响

注：与对照组相比，P>0.05

2.3.3血液生化指标 实验末期，各剂量组血液生化指标与对照组比较，0.418g/kg·BW剂量组雄性大鼠总蛋白含量显著升高(P<0.05)，但此指标的变化在实验室对照组历史正常检测范围内，该指标的升高无生物学意义。0.835g/kg·BW和1.670g/kg·BW剂量组雌性大鼠甘油三酯含量明显低于对照组(P<0.05)，该指标的

降低无生物学意义。其余各剂量组血生化检测结果与对照组比较均无显著性差异(P>0.05)(表6～7)。

2.3.4对大鼠脏器重和脏体比的影响 各剂量组大鼠脏器重肝、脾、肾、睾丸(卵巢)及实验末空腹体重，脏体比肝/体、脾/体、肾/体、睾丸(卵巢)/体和阴性对照组比较均无显著性差异。

2.3.5组织病理学检查 对照组和高剂量组进行组织病理学检查，个别动物的肝脏中发现轻度肝细胞脂肪变性(对照组4/20例、高剂量组4/20例)，小灶性炎细胞浸润(对照组4/20例、高剂量组2/20例)，肾脏出现局灶性肾小管再生(对照组1/20例、高剂量组0/20例)、肾脏内局灶性纤维组织增生及炎细胞浸润(对照组1/20例、高剂量组0/20例)，以上肝脏和肾脏的病理学改变是动物常见自发病变，并且高剂量组的病变发生率与对照组无显著性差异，因此该病变和受试物无关。其余脏器包括脾、胃及十二指肠、睾丸和卵巢未发现明显异常。因此，与对照组比较，虾青素并未引起动物肝、肾、脾、胃及十二指肠、睾丸(卵巢)的病理学改变。

表5 虾青素软胶囊对大鼠白细胞分类的影响

注：与对照组比较，*P<0.05

表6 虾青素软胶囊对大鼠血液生化指标的影响

注：与对照组比较，*P<0.05

3 讨论

虾青素广泛存在于水生动物体中，人类日常食用的甲壳类和鱼类等水产品中的虾青素含量最高[6-7]。人类的日常食物中含有大量的虾青素，摄入天然食物中的虾青素是安全的，而对于提取浓缩和加工合成的虾青素还有待进一步研究。近年来，人们对商品化的虾青素产品的安全性也逐渐开展了相关的毒理学研究。刘敏等[8]研究虾青素粉末制剂的急性毒性和遗传毒性作用，结果表明，小鼠的经口LD50>1g/kg·BW，虾青素属于无毒级，并未见遗传毒性作用。曲见松等[9]对虾青素软胶囊(油溶制剂)的遗传毒性进行研究，也未发现具有遗传毒性。陈燕[10]对虾青素相关的功能产品“虾青素人参当归茶叶软胶囊”进行了安全性毒理学评价，该产品在急性毒性、遗传毒性和30d喂养试验中无明显毒副作用。本实验针对虾青素软胶囊开展毒性研究，结果表明，虾青素软胶囊对雌、雄大鼠的急性经口最大耐受量(MTD)均大于19.0g/kg·BW。Ames试验、小鼠骨髓微核试验和精子畸形试验结果均未见该样品有致突变作用。大鼠30d喂养试验结果显示，实验动物活动正常，无明显中毒症状，生长发育良好，各剂量组动物体重、进食量、食物利用率、血液学、血生化、脏器重量以及脏体比均未见异常，病理检查也未见由受试物引起的异常改变。因此，在本实验条件下虾青素未见明显毒副作用，为虾青素作为保健食品的研究开发提供了重要的毒理学科学依据。◇

表7 虾青素软胶囊对大鼠血液生化指标的影响

注：与对照组比较，*P<0.05