老龄化对单侧肾切除术后大鼠青霉素排泄的影响

张兴宇 隋鲜鲜 陈天 王见之

(复旦大学 1基础医学国家级实验教学示范中心，上海 200032；2上海医学院2013级临床医学八年制)

临床上，活体肾移植主要供体之一的扩展标准供体(ECD)年龄较大〔1，2〕，在国内主要是患者的父母或者兄弟姐妹，人群年龄大、机体耐受差。另外，对于罹患肾细胞癌(RCC)的老龄个体，肾切除术亦为目前临床常用的手段〔3〕。肾切除术如何影响老龄个体术后肾功能和肾脏对抗生素类药物的排泄能力及老龄化是否加重术后肾损伤目前尚无全面报道。青霉素作为临床肾切除术后的常规用药之一，主要通过肾脏排泄。本研究探究老龄大鼠单侧肾切除术后抗生素类药物排泄的规律和肾功能的变化。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组 清洁级健康青龄雄性SD大鼠〔(262.5±28.2)g，3月龄〕16只，清洁级健康老龄雄性SD大鼠〔(616.3±42.4)g，18月龄〕16只，购自复旦大学实验动物科学部。将大鼠称重，并随机分为4组：青龄对照组，不手术给予青霉素，1万U/100 g体重，青龄手术组，行右侧肾切除术并给予青霉素，1万U/100 g体重；老龄对照组，不手术给予青霉素，1万U/100 g体重，老龄手术组，行右侧肾切除术并给予青霉素，1万U/100 g体重，每组各8只大鼠。所有大鼠在标准条件下(温度23℃±2℃，湿度60%±5%)适应性饲养7 d，标准饲料，自由取水。

1.2主要溶液及试剂 20%乌拉坦溶液、生理盐水由复旦大学基础医学国家级实验教学示范中心提供；注射用青霉素钠购自华北制药股份有限公司；肌酐(Cr)与尿素氮(BUN)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；藤黄微球菌(ATCC9341)、抗生素检定培养基2号购自上海科玛嘉微生物技术有限公司。

1.3单侧肾切除大鼠模型制备 手术组大鼠经20%乌拉坦麻醉(0.7 ml/100 g，腹腔注射)，俯卧位固定于鼠手术台，并用电热板保持术中温度。于右侧后胸廓下、靠近脊柱1.0～1.5 cm处行约2.0 cm斜向外下方切口，逐层分离大鼠皮肤、肌肉、背腹膜、肾脂肪囊，暴露右侧肾脏并结扎肾蒂，切除整个右肾，称重后甲醛固定备用。明胶海绵止血，分别缝合肌肉与皮肤。实验步骤：术前3 d各组腹腔注射青霉素，于注射后60 min尾静脉采血。手术当日，对照组(青龄，老龄)腹腔注射青霉素，60 min后采血。手术组大鼠(青龄，老龄)术后待动物自然苏醒后，青霉素注射、60 min后采血，方法同前。术后连续给予手术组青霉素(4万U/只)5 d以防止感染。术后10 d后各组青霉素注射、60 min后采血，方法同前。血液样本于4℃冰箱静置1 h后，3 000 r/min离心10 min，取上清，放入-80℃冰箱保存待测。

1.4血清青霉素浓度测定 根据《中华人民共和国药典2010年版》管碟法测定〔4〕，质控菌种为藤黄微球菌(ATCC9341)，肉汤培养基27℃扩增至OD600 nm=0.5后放入4℃冰箱保存待用。无菌条件下倒平板(直径90 mm)，底层为20 ml抗生素检定培养基2号，待底层凝固后，按照菌液与培养基体积之比1∶50配比菌层5 ml，四象限法放置牛津杯(规格10 mm×8 mm×6 mm)，牛津杯内加入20 μl血清样品。另配置青霉素标准液，每个牛津杯内加入20 μl用于制作标准曲线。将培养基平稳置于27℃培养20 h，游标卡尺测量抑菌圈的直径，根据直线拟合所得青霉素的标准曲线计算血清中的青霉素浓度。

1.5血清肌酐、尿素氮浓度测定 肌酐测定的原理为苦味酸比色法，10倍量钨酸沉淀剂将血清中的蛋白沉淀，离心取上清后加入苦味酸试剂和0.75 mol/L氢氧化钠试剂，37℃水浴10 min，波长510 nm，光径1 cm，测定吸光度。尿素氮测定的原理为脲酶法，血清经脲酶于37℃水浴中作用10 min后，加入酚显色剂和碱性次氯酸钠，再次37℃水浴10 min，波长640 nm，光径1 cm，测定吸光度。得到各管的OD值，根据下列公式计算相应浓度。

1.6大鼠肾脏重量测量 实验完成后取各组左肾并称重，甲醛固定备用，与手术切除的右肾的重量做统计学分析。

1.7肾脏组织病理学及肾脏损伤评分 将甲醛固定的肾组织制成3 μm厚度的苏木素-伊红(HE)切片。每张切片随机选取5个视野，按照以下标准取平均值进行病理学诊断：肾小球、肾小管、肾间质均正常评分为0分；损伤部分占比镜下观察部分33%以下的评分为1分(轻度损伤)；占33%～67%为2分(中度损伤)；占67%以上为3分(重度损伤)〔5〕。

1.8统计学方法 采用SPSS19.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1青、老龄大鼠手术前、后青霉素浓度比较 根据术后采血样本的抑菌环直径(表1)，拟合得青霉素浓度C(U/L)对数值与抑菌环直径d(mm)的线性关系为lgC=0.104 7×d+2.657 2(R2=0.996，见图1)。术前3 d，青龄大鼠和老龄大鼠组内血清青霉素浓度均无显著差异(均P>0.05)，但是手术组内老龄大鼠的血清青霉素浓度显著高于青龄大鼠(P<0.01)。手术当日，即刻测得血清青霉素浓度，青龄大鼠和老龄大鼠单肾对青霉素排泄明显下降(青龄组内P<0.001，老龄组内P<0.05)。术后10 d时，手术组青龄大鼠血清青霉素浓度与对照组无显著差异(P>0.05)，但老龄手术组大鼠显著高于老龄对照组(P<0.01)，同时，手术组内老龄大鼠血清青霉素浓度显著高于青龄大鼠(P<0.001)。见表1。

2.2青、老龄大鼠手术前后肾功能生化指标比较 与术前3 d Cr相比，青龄、老龄手术组大鼠术后10 d时血清Cr、BUN浓度均无显著变化(P>0.05)；老龄手术组大鼠的术后10 d时血清Cr、BUN浓度显著高于青龄手术组(P<0.01，P<0.001)。见表2。

图1 青霉素浓度(U/L)对数值-抑菌环直径(mm)的线性回归

时间抑菌环直径(mm)青龄对照组青龄手术组老龄对照组老龄手术组青霉素(U/L)青龄对照组青龄手术组老龄对照组老龄手术组术前3 d9.79±0.269.89±0.2014.44±1.7614.48±1.684 813.65±483.954 925.17±477.0514 750.48±693.4014 911.38±680.321)手术当日9.80±0.2813.70±0.8215.28±3.1519.71±0.834 825.27±485.4112 355.26±552.883)18 072.41±971.4652 518.64±554.604)术后10 d9.90±0.219.88±0.5314.48±1.6818.80±0.884 937.06±478.204 910.35±516.6314 911.38±680.3242 249.52±561.072)5)

与青龄手术组比较：1)P<0.01,2)P<0.001，与青龄对照组比较：3)P<0.001，与老年对照组比较：4)P<0.05,5)P<0.01；表2同

表2 青、老龄大鼠手术前后肾功能生化指标比较

2.3青、老龄大鼠手术前后肾脏质量比较 青龄大鼠术后10 d时左侧肾脏质量为(1.66±0.19)g，与术前右侧肾脏质量(1.35±0.13)g相比明显增加(P<0.05)。老龄大鼠术后10 d时左侧肾脏质量为(2.00±0.10)g，与术前右侧肾脏质量(1.45±0.16)g相比明显增加(P<0.01)。老龄大鼠术后10 d时左侧肾脏质量显著大于青龄大鼠(P<0.05)。

2.4各组大鼠肾脏组织病理学及肾脏损伤评分 青龄对照组和手术组镜下可见肾小球形态正常、小管清晰未狭窄，未见间质炎症反应。老龄对照组肾脏组织内可见少量单个核细胞浸润，肾小球形态较正常、小管上皮未见肿胀或萎缩。但是，老龄手术组肾脏组织内可见肾小球肿胀、萎缩，周围有明显纤维化及瘢痕，肾小管上皮肿胀脱落、管腔狭窄，最重要的是可见肾小管、间质小灶性损伤、炎症反应及明显纤维化，并伴有大量单个核细胞浸润，见图2。肾脏病理评分显示，青龄大鼠组内肾脏损伤评分无明显差异〔对照组(0.25±0.16)分、手术组(0.63±0.26)分，P>0.05〕，老龄大鼠组内手术组术后10 d时肾脏损伤明显强于对照组〔对照组(1.38±0.18)分、手术组(2.50±0.27)分，P<0.01〕。手术组内老龄大鼠损伤评分明显高于青龄大鼠(P<0.001)。

图2 各组肾脏组织病理学及肾脏损伤评分(黑箭头：纤维化，×10)

3 讨 论

相对于青年个体，老年个体肾切除术后各时段生存率均较低〔6〕，说明在同样肾切除术应激条件下，老龄化可引起肾切除个体死亡率的增加，即意味着临床上应当针对老年肾切除个体加强术后监测及护理。本实验说明肾切除术本身并不影响肾小球滤过功能，这是由于健存肾代偿性肥大及肾血浆流量导致的高灌注，肾小球处于高滤过状态，以维持机体排泄需求〔7〕。因此，针对老龄个体，本实验证实了肾切除并不对肾功能产生明显削弱作用。

老年患者肾切除术后护理有必要使用抗生素防止感染〔8〕，但需减量使用抗生素类药物。老龄个体在围术期对各种药物的排泄规律及药物机体相互作用有待进一步探讨。

本实验提示老龄化可能加重肾切除术大鼠健存肾的损伤。老龄化可能诱发肾切除术后慢性纤维化损伤。但是，老龄化诱发的肾小管、间质纤维化是否会导致术后肾病的发生，则有待研究。