长期负性情绪应激对大鼠学习记忆及海马Ca2+/CaM-CaMKⅡ-CREB信号通路的影响

詹向红 吕茹 王慧霞 刘永 李伟 刘胜利

(河南中医药大学认知神经科学实验室，河南 郑州 450046)

随着生活方式的转变，人们承受的各种精神压力和情绪刺激不断增加，若情绪调节不良，可严重影响人类的身心健康，加速机体正常衰老进程，并引发学习记忆障碍、痴呆、抑郁症、免疫力低下等多系统疾患〔1〕，目前关于认知功能衰退的确切机制尚不清楚。有研究发现，慢性应激性抑郁会引起海马神经元谷氨酸(glu)含量升高，N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)过度激活〔2〕，细胞膜对钙离子(Ca2+)通透性增加，大量Ca2+内流导致细胞内钙超载。而钙在神经生长及突触重塑方面有非常重要的作用〔3〕，它通过与特异性的钙调蛋白(CaM)结合，进一步激活下游信号通路〔如环腺苷酸反应元件结合蛋白(CREB)〕，调控与认知相关的基因转录〔4〕，影响大脑的学习记忆能力，因此认为Ca2+浓度的改变在阿尔茨海默病(AD)和血管性痴呆(VD)中起关键作用〔5，6〕。可见，慢性负性情绪应激可以使神经细胞内钙代谢失衡，进而影响认知功能。本课题组前期研究证实长期单一负性情绪应激是老年性痴呆发病的危险因素〔7〕，但在日常生活中，人们更多处于多种负性情绪的复合应激状态，其对认知衰退进程的影响及其机制尚不清楚。因此，本实验拟观察长期负性情绪应激对大鼠学习记忆能力的影响，并从钙信号通道探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级3月龄Wistar大鼠56只，购于山东鲁抗公司(SCXK〔鲁〕2013-0001)，雌雄各28只，雄鼠体重(360±10)g，雌鼠体重(300±10)g。实验在河南省中医药研究院动物实验中心IVC环境动物实验室(SYXK〔豫〕2012-0009)进行，并经河南中医药大学动物伦理委员会批准。

1.2分组及造模

1.2.1分组 Wistar大鼠正常饲养1 w后，按体重剔除2只偏大的个体，剩余54只大鼠采用随机数字表法分为空白对照组、D-半乳糖(gal)脑老化阳性对照组(以下简称D-gal脑老化组)、长期负性情绪应激组(以下简称负性情绪应激组)，每组14只，雌雄各半，其余12只作为攻击鼠。各组雌雄大鼠分笼饲养，自由饮食饮水。

1.2.2动物处理 D-gal脑老化组：参考李文彬〔8〕的方法，于大鼠颈背部皮下多位点注射D-gal 0.1 g/(kg·d)，连续6 w，复制D-gal脑老化大鼠模型，作为阳性对照。空白对照组：于同样部位注射等容积的生理盐水，1次/d，连续6 w。负性情绪应激组：采用本课题组优化和改良的不可预知性刺激诱发长期负性情绪应激〔9，10〕。自实验第15天开始，负性情绪应激组大鼠分别依次接受8种不同的刺激(束缚、温水游泳、间接电击、摇晃、强光、潮湿垫料、噪声、惩罚性饮水)，每天1种，随机出现，持续4 w。

1.3认知功能检测 参照李文彬〔8〕实验方法，实验第37天开始进行为期6 d的空间学习记忆能力测试，记录大鼠寻找水下平台的潜伏期，即寻台时间(SPL)，以此作为定位学习记忆成绩；在相同的条件下，寻台时间越长说明学习记忆能力越差。

1.4海马CA1区锥体细胞Ca2+/CaM通路的检测 ①采用高效液相法测定glu浓度：取冻存的脑匀浆样品溶液12 μl，于进样瓶中加入衍生试剂6 μl，四硼酸钠缓冲液(pH9.18)480 μl，混匀，20℃静置3 min后进样和检测。 ②采用荧光免疫染色法检测细胞内Ca2+浓度：磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤待测样本，Rhod2-AM探针终浓度为4 μmol/L，37℃孵育20 min；PBS洗涤3次，充分去除未进入细胞内的探针；用高内涵成像系统检测细胞内Ca2+含量。③采用Western印迹方法测定NMDAR、CaM和P-CREB的含量：按试剂盒说明进行规范操作。应用Gel-Pro3软件对结果进行灰度分析，以GAPDH为内参照，计算NMDAR、CaM、P-CREB/GAPDH光密度比值，反映NMDAR、CaM、P-CREB相对含量变化。

1.5统计方法 采用SPSS22.0软件，三组实验数据进行方差分析，各组间两两比较用LSD-t法。

2 结 果

2.1一般情况观察 空白对照组大鼠皮毛光泽度好，反应灵敏，活动自如，精神状态良好；D-gal脑老化组和负性情绪应激组大鼠一般情况大致类似，均呈现毛发杂乱、无光泽，精神倦怠，反应迟钝，活动减少等情况。

2.2长期负性情绪应激对大鼠认知功能的影响 与空白对照组〔(22.10±11.22)s〕相比，D-gal脑老化组〔(30.08±7.60)s〕和负性情绪应激组〔(30.13±10.43)s〕SPL均明显延长(P<0.05)；D-gal脑老化组与负性情绪应激组的SPL无明显差异，均耗费较长时间寻找跳水平台。

2.3长期负性情绪应激对CaM通路的影响

2.3.1长期负性情绪应激对海马神经元内glu和Ca2+浓度的影响 与空白对照组相比，D-gal脑老化组和负性情绪应激组海马神经元glu含量和Ca2+浓度均显著增加(P<0.05)；D-gal脑老化组与负性情绪应激组海马神经元glu含量和Ca2+浓度比较无明显变化。见表1。

2.3.2长期负性情绪应激对海马神经元NMDAR、CaM、P-CREB的影响 与空白对照组相比，D-gal脑老化组和负性情绪应激组海马神经元NMDAR含量均显著增加(P<0.05)，CaM和P-CREB含量均显著下降(P<0.05)；与D-gal脑老化组相比，负性情绪应激组海马神经元内CaM含量明显升高(P<0.05)，NMDAR和P-CREB含量无显著差异，见表2。

表1 各组海马神经元内glu和Ca2+浓度的比较

与空白对照组比较：1)P<0.05

表2 各组海马NMDAR、CaM、CREB含量比较

与空白对照组比较：1)P<0.05；与D-gal脑老化组比较：2)P<0.05

3 讨 论

D-gal注射方法制备脑老化模型，主要机制是氧化应激产生大量自由基，进而钙稳态失调造成线粒体不可逆损伤、神经退行性变，最终表现为认知功能下降〔11，12〕，此法被公认能较好模拟自然衰老与脑老化状态。因此，本实验选择D-gal注射方法制备脑老化大鼠模型，并作为阳性对照。实验结果显示，负性情绪应激组大鼠与D-gal脑老化大鼠一样，均呈现拟衰老及脑老化效应，与课题组前期研究结果一致，即慢性负性情绪应激可降低大鼠的兴奋性、探究趋势及认知功能〔13〕。

海马是情绪、学习与记忆、免疫等的调节中枢〔14，15〕，海马神经元的兴奋性传递主要由glu受体介导，glu能系统异常与痴呆发病的关系尤为密切。NMDAR是glu受体亚型之一，在海马及大脑皮层分布密集，可调节学习记忆突触的可塑性〔16〕。长期负性情绪应激可刺激海马，使突触前glu大量释放，激活NMDAR，促使细胞内Ca2+浓度升高，引起兴奋毒性的产生。Ca2+浓度的升降对调节细胞活动起着决定性作用，在生理浓度范围内，Ca2+浓度升高可通过激活Ca2+-CaM-钙调蛋白激酶(CaMK)Ⅱ-CREB信号转导通路促进学习记忆的形成，Ca2+结合CaM后激活CaMKⅡ，有活性的CaMKⅡ在学习记忆过程中发挥重要的作用，通过P-CREB蛋白KID区的Ser133，使启动子序列上的CRE元件乙酰化，同时启动基因转录〔17〕；CREB介导的基因转录影响脑源性神经生长因子(BDNF)的表达，而BDNF在脑的发育、分化和突触重塑等方面发挥重要作用。因此，Ca2+-CaM-CREB信号通路直接参与调控大脑学习记忆能力。

本研究发现，负性情绪应激组大鼠海马神经元glu、NMDAR含量和Ca2+浓度均显著升高，CaM和P-CREB含量均显著下降。前三个指标升高，推测可能是由于长期负性情绪应激引起了大鼠海马神经元突触释放大量的glu，与之结合的NMDAR增加，引起神经元在兴奋过程中大量Ca2+流入，Ca2+浓度过高会产生细胞毒性。然而，现代研究已证实〔18〕，细胞存在自我保护机制，为抑制神经元内Ca2+浓度过高，CaM可能更多地与钙通道的Cavl.2的c末端结合，使游离CaM含量下降，同时两者结合使钙通道失活〔19〕，这就导致CaM与Ca2+结合量减少，激活CaMKⅡ的能力减弱，使得P-CREB含量下降，其调节转录的能力失控，学习记忆相关蛋白合成障碍，表现为大鼠学习记忆能力下降，这也正是负性情绪应激大鼠SPL延长的原因所在。虽然负性情绪应激组和D-gal脑老化组大鼠海马神经元CaM含量较空白对照组下降，但负性情绪应激组CaM含量下降程度不及D-gal脑老化组。可见，两者海马神经元的损伤程度不完全一致，其具体原因还需进一步研究。

综上，长期负性情绪应激是加速认知衰退进程的重要原因之一，其部分机制是通过Ca2+/CaM-CaMKⅡ-CREB信号通路影响与学习记忆相关蛋白的表达，从而导致学习记忆能力下降。