高效液相色谱－蒸发光散射法测定绞股蓝中绞股蓝皂苷XLIX含量

胡晓安，高 翔 ，胡萌萌 ，徐世明 ，乔蓉霞 ，马鹏飞

（1.陕西省食品药品监督检验研究院，陕西 西安 710061； 2.北京大学安康药物研究院，陕西 安康 725000）

绞股蓝 Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino，又名七叶胆[1]、遍地生根、公罗锅底、小苦药、五叶参等[2－3]，为葫芦科绞股蓝属多年生草质藤本植物[4]，主要分布于秦巴山区及长江流域以南广大地区[5]。绞股蓝中含皂苷、多糖、黄酮、甾醇类、氨基酸及微量元素等多种化学成分[6－7]。其质量标准收载于《陕西省中药饮片标准（第三册）》和2009年版《湖南省中药材标准》，均无含量测定项目，是因为无可用于含量测定的法定对照品。国家药典委员会2010年提出绞股蓝药材质量标准提高研究任务，研究制订绞股蓝质量标准。陕西省食品药品监督检验研究院从2009年起对绞股蓝皂苷XLIX对照品的制备、结构鉴定进行了深入研究，制备的对照品于2017年9月通过中国食品药品检定研究院的审核与标定，现已发售。本研究中采用高效液相色谱－蒸发光散射（HPLC－ELSD）法测定绞股蓝皂苷XLIL对照品的含量，该法简单快速、专属性强、重复性良好。现报道如下。

1 仪器与试药

仪器：Allance 2690型高效液相色谱仪（Waters公司）；2000ES型蒸发光散射检测器（Alltech公司）；M2P型电子天平（十万分之一），BP61型电子天平（万分之一），均购自德国赛多利斯公司；KQ5200E型超声波清洗器（常州诺基仪器有限公司）。

试药：绞股蓝皂苷XLIX对照品（批号为112033－201701，标示含量为94.4%，购自中国食品药品检定研究院）；绞股蓝药材选取产地为陕西平利县北京大学安康药物研究院绞股蓝种植基地（通过国家GAP认证），批号分别为 20080302，20100523，20161126，经徐世明教授鉴定为葫芦科植物绞股蓝 Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino；乙腈、甲醇（TEDIA 公司）为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Dubhe C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；柱温：室温；检测波长：203 nm；流速：1 mL ／min；流动相：乙腈（A） － 超纯水（B），梯度洗脱（见表 1）。用蒸发光散射检测器检测，流速为2.7 L／min，雾化温度为99.7℃。理论板数按绞股蓝皂苷XLIX峰计算大于5 000。

表1 流动相梯度洗脱表

2.2 溶液制备

称取对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含绞股蓝皂苷XLIX 0.4 mg的溶液，即得对照品溶液。取绞股蓝新鲜全草，晾干，粉碎处理，过四号筛后，取粉末约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率200 W，频率40 kHz）20 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，精密量取上清液25 mL，挥干，残渣用甲醇溶解并移至5 mL容量瓶中，定容，摇匀，滤过，取续滤液[8]，即得供试品溶液。

2.3 测定法

精密吸取对照品溶液15 μL和25 μL，供试品溶液10 μL，分别注入液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱－蒸发光散射色谱图

2.4 方法学考察

线性关系考察：精密吸取对照品溶液（质量浓度为0.412 3 g ／L）5，10，15，20，25，30 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积值，以进样量的自然对数值为横坐标（X）、峰面积的自然对数值为纵坐标（Y）进行线性回归，得回归方程 Y＝1.718 6 X＋4.667 7，r2＝0.998 2（n＝6）。结果表明，股蓝皂苷XLIX进样量在2.061 5～12.936 0 μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取对照品溶液15 μL，在拟订色谱条件下，连续进样5次。结果绞股蓝皂苷XLIX峰面积值的 RSD为1.45%（n＝5），表明仪器精密度好。

稳定性试验：称取绞股蓝皂苷XLIX对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含绞股蓝皂苷XLIX 0.4 mg的溶液，另取样品（批号为20161126）按2.2项下供试品溶液方法制备，分别放置 0，1，2，4，6，7 h 时各进样20 μL，测定绞股蓝皂苷 XLIX的峰面积。结果的 RSD分别为1.32%和1.75%（n＝6），表明对照品溶液和供试品溶液均在7 h内稳定。

重复性试验：取样品6份（批号为20080302）粉末（过四号筛）约1 g，精密称定，按2.2项下供试品溶液方法制备，依法测定含量。结果绞股蓝皂苷XLIX平均含量为0.76%，RSD 为 0.94% （n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取本品（批号为20080302，绞股蓝皂苷 XLIX含量为 0.76%）粉末（过四号筛）约 0.6，0.5，0.4 g，各 3 份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入绞股蓝皂苷XLIX甲醇溶液（质量浓度为0.748 g／L）各 4.0，5.0，6.0 mL，按 2.2 项下方法制备供试品溶液，依法测定含量，计算回收率。结果见表2。

表2 绞股蓝皂苷XLIX加样回收试验结果（n＝9）

2.5 样品含量测定

取不同批号的绞股蓝，同法制备供试品溶液，依法测定，以外标两点法对数方程计算含量。结果批号为20080302，20100523，20161126的样品平均含量分别为0.76% ，0.58% ，0.51% ， RSD 分别为 0.94% ，1.41% ，1.35（n ＝3）。

3 讨论

绞股蓝皂苷XLIX具有四环三萜的达玛烷型结构[9－10]，紫外最大吸收波长为203 nm[11]，紫外检测器响应值低、干扰大，而蒸发光散射检测器具有专属性好、本底噪声小、检测相应值高等特点[12－13]。

绞股蓝皂苷含有多种化学成分且具有多种药理作用[14－15]，目前已分离得到136种[13]。药理学动物实验证明，其主要有效成分是绞股蓝皂苷XL1X和绞股蓝皂苷A[12－13，16]。因此，应探讨以绞股蓝皂苷 XLIX 和绞股蓝皂苷A作为标准品进行质量标准的研究。

流动相分别考察了甲醇－水、乙腈－水系统的分离情况，比较绞股蓝皂苷XLIX峰形、分离度可知，乙腈－水系统优于甲醇－水系统。适当调整乙腈－水的梯度洗脱比例，样品中所有峰均可在20 min内出峰完毕。

专属性考察采用液相色谱－质谱（LC－MS）法进行峰纯度检查。使用 Aglient 1200型高效液相色谱仪，Bruker HCT大容量离子阱质谱仪，依法制备供试品溶液和对照品溶液，注入LCMS比较两者绞股蓝皂苷XLIX峰的相对分子质量，结果表明，对照品与供试品溶液中绞股蓝皂苷XLIX相应保留时间出峰的化合物具相同的相对分子质量，供试品绞股蓝皂苷XLIX峰中未夹杂其他杂质，表明该法专属性良好。